Introduction

Cenchrus purpureus (Schumach.) Morrone, formerly Pennisetum purpureum, is one of the most important forage grasses in tropical livestock systems and its use in ruminants feeding through cutting or grazing is notable. In addition, other uses are reported as an ornamental and medicinal plant, in the industry its fiber is used for paper manufacturing and as biofuel (Nguyen et al. 2021Nguyen, B.T., Le, L.B., Pham, L.P., Nguyen, H.T., Tran, T.D. & Van Thai, N. 2021. The effects of biochar on the biomass yield of elephant grass (Pennisetum purpureum Schumach) and properties of acidic soils. Industrial Crops and Products, 161: 113224, ISSN: 1872-633X. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.113224. , Tan et al. 2022Tan, F., He, L., Zhu, Q., Wang, Y., Chen, C. & He, M. 2022. Pennisetum hydridum: a potential energy crop with multiple functions and the current status in China. BioEnergy Research, 15: 850-862, ISSN: 1939-1242. https://doi.org/10.1007/s12155-021-10263-7., Wessapak et al. 2023Wessapak, P., Ngernsaengsaruay, C. & Duangjai, S. 2023. A taxonomic revision of Cenchrus L. (Poaceae) in Thailand, with lectotypification of Pennisetum macrostachyum Benth. PhytoKeys, 234: 1-33, ISSN: 1314-2003. https://doi.org/10.3897/phytokeys.234.106486. and POWO 2025POWO. 2025. Plants of the World Online. Kew Royal Botanic Gardens. Available at: https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:77106033-1. [Consulted: January 03, 2025].).

At the Instituto de Ciencia Animal (ICA) of the Republic of Cuba, accessions of C. purpureus developed through the genetic improvement program of this genus aimed at increasing biomass production, nutritional quality and tolerance to abiotic stresses such as salinity and drought are conserved (Herrera 2022Herrera, R.S. 2022. Evaluation of Cenchrus purpureus varieties tolerant to drought in the western region of Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 56(2): 135-143, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/1049. , Fortes et al. 2023Fortes, D., Herrera, R.S. & Herrera, M. 2023. Morphoagronomic performance of Cenchrus purpureus new clones. Cuban Journal of Agricultural Science, 57: 8, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/1105. and Álvarez et al. 2024Álvarez, Y., Herrera, R.S., Ramírez, J.L., Verdecia, D.M., Benítez, D. & López, S. 2024. Performance of Cenchrus purpureus varieties tolerant to salinity under the edaphoclimatic conditions of Granma province, Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 58: e01, ISSN: 2079-3480. https://cu-id.com/1996/v58e01. ). This collection was evaluated for forage production and response to grazing using morphological and quality indicators (Herrera et al. 2019Herrera, R., García, M. & Cruz, A.M. 2019. Study of morphoagronomic indicators of Cenchrus purpureus clones for biomass production. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 189-196, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/886. ) and molecular markers such as isozymes, Simple Sequence Repeat (SSR) and regions between simple sequence repeat (ISSR) (Cruz et al. 1993Cruz, R., Sosa, A., Herrera, R.S. & Martínez, R.O. 1993. Identificación electroforética de Pennisetum purpureum cv. King grass. Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 27(2): 219-223, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS. , González and Martínez 2019González, C. & Martínez, R.O. 2019. Genetic characterization of clones and varieties of Cenchrus purpureus with microsatellite markers. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 307-318, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/914. and Álvarez 2021Álvarez Báez, Y. 2021. Comportamiento productivo de nuevas variedades de Cenchrus purpureus en el Valle del Cauto, Cuba. Tesis de Doctorado. Universidad de Granma. Cuba. p. 99.).

Molecular markers are fundamental tools for characterizing genetic diversity, optimizing germplasm conservation, and designing assisted selection strategies (Özbek 2024Özbek, Ö. 2024. Molecular Markers Used to Reveal Genetic Diversity and Phylogenetic Relationships in Crop Plants. OBM Genetics, 8(4): 1-25, ISSN: 2577-5790. https://doi.org/10.21926/obm.genet.2404274.). Currently, specific primers exist for studying genetic diversity in plants, such as the plant DNA barcode markers rbcL and matK, which are used in phylogenetic studies of flowering plants and conifers (de Vere et al. 2012de Vere. N., Rich, T.C.G., Ford, C.R., Trinder, S.A., Long, C., Moore, C.W., Satterthwaite, D., Davies, H., Allainguillaume, J., Ronca, S., Tatarinova, T. Garbett, H., Walker, K. & Wilkinson, M.J. 2012. DNA Barcoding the Native Flowering Plants and Conifers of Wales. PLoS ONE, 7(6): e37945, ISSN: 1932-6203. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0037945. and Jones et al. 2021Jones, L., Twyford, A.D., Ford, C.R., Rich, T.C., Davies, H., Forrest, L.L., Hart, M.L., McHaffie, H., Brown, M.R., Hollingsworth, P.M. & De Vere, N. 2021. Barcode UK: A complete DNA barcoding resource for the flowering plants and conifers of the United Kingdom. Molecular Ecology Resources, 21(6): 2050-2062. ISSN: 1755-0998. https://doi.org/10.1111/1755-0998.13388. ). However, other markers derived from the ITS (Internal Transcribed Spacer) region of the nuclear ribosomal DNA are notable for their utility in identifying different evolutionary levels such as fungi, bacteria, and plants; in the latter, their use stands out in phylogenetic studies at the genus and species level due to their high nucleotide substitution rate and wide availability in databases (Alaklabi 2021Alaklabi, A. 2021. Ficus Species Genetic Diversity Based on Internal Transcribed Spacer (ITS) Region Analysis. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, H. Botany, 12(1): 21-27, ISSN: 2090-3820. https://doi.org/10.21608/eajbsh.2021.148134. ).

In Poaceae, this region has clarified taxonomic relation in genera such as Sorghum (Sun et al. 1994Sun, Y., Skinner, D.Z., Liang, G.H. & Hulbert, S.H. 1994. Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Theoretical and Applied Genetics, 89: 26-32, ISSN: 1432-2242. https://doi.org/10.1007/BF00226978.), Urochloa (González and Morton 2005González, A.T. & Morton, C.M. 2005. Molecular and morphological phylogenetic analysis of Brachiaria and Urochloa (Poaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 37(1): 36-44, ISSN: 1095-9513. https://doi:10.1016/j.ympev.2005.06.003. ), Chloris (Liao et al. 2020Liao, H.C., Ming-Hui, C. & Chih-Hui, C. 2020. Barcode of nuclear ribosomal internal transcribed spacer regions (ITS) as a useful tool to recognize a newly naturalized and potentially invasive weed, Chloris pilosa Schumach. (Poaceae), in Taiwan. Taiwania, 65(2): 129, ISSN: 0372-333X. https://doi.org/10.6165/tai.2020.65.129. ), Phalaris (Al Rahbawi et al. 2021Al Rahbawi, S.M., Al-Edhari, A.H. & Sardar, A.S. 2021. Phylogenetic Study of the Genus Phalaris L. (Poaceae) based on Nuclear Internal Transcript Region (ITS) in Iraq. Annals of the Romanian Society for Cell Biology, 25(3): 8278-8281, ISSN: 2067-8282. http://annalsofrscb.ro/index.php/journal/article/view/2368. ) and the species Cenchrus americanus (L.) Morrone (Almutairi 2021Almutairi, Z.M. 2021. Molecular identification and phylogenetics of local pearl millet cultivars using internal-transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 19(4): 339-346, ISSN: 1479-2621. https://doi.org/10.1017/S1479262121000393. ). However, there is a not study reported in the literature where ITS primers are used in C. purpureus, which limits its genomic information, which in turn restricts its application in phylogenetic and intraspecific diversity studies, and its management in genetic improvement programs.

In Cuba, studies using molecular markers in C. purpureus are scarce and have focused on traditional markers, limiting the understanding of its genomic diversity. Therefore, the objective of this study was to identify a fragment of the ITS region using the universal primers ITS1/ITS4 in C. purpureus and contribute to the molecular genetics knowledge for future phylogenetic and assisted selection analyses.

Materials and Methods

This research was conducted in the DNA Laboratory, belonging to Semillas del Futuro building, at the Alliance of Bioversity International and the International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Valle del Cauca, Colombia.

Plant material: the samples under study were obtained from 62 accessions of C. purpureus, with similar regrowth age and cultivation conditions, preserved in the germplasm bank of grasses and forages, belonging to the Experimental Center of Grasses and Forages Miguel Sistachs Naya from Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, located at 22º 53 NL and 82º 02 WL at 80 m.o.s.l. Additionally, two samples of Urochloa decumbens (Stapf) R. D. Webster - CIAT 606 and Urochloa ruziziensis (R. Germ. & C. M. Evrard) Crins - CIAT 6713 were included from the Genetic Resources Program of the Alliance of Bioversity International and the International Center for Tropical Agriculture, Colombia.

DNA extraction and amplification: for the extraction of genomic DNA, the modified MATAB method was used (Risterucci et al. 2000Risterucci, A., Grivet, L., N’Goran, Pieretti, J., Flament, M. & Lanaud, C. 2000. A high-density linkage map of Theobroma cacao L. Theoretical and Applied Genetics, 101: 948-955, ISSN: 0040-5752. https://doi.org/10.1007/s001220051566.). The DNA amplification was performed by polymerase chain reaction (PCR), using the ITS1/ITS4 direct and reverse primer combination described by White et al. 1990White, T. J., Bruns, T., Lee, S.J.W.T. & Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: a guide tomethods and applications. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky & T. White (eds.). Academic Press, INC. San Diego California. pp. 315-322. ISBN: 0-12-372181-4. (table 1).

The PCR mixture was performed in a final volume of 12 μL, using 4 μL of 2X Promega buffer (GoTaq^® Green Master Mix), 0.2 μL of ITS1 and ITS4, with a final concentration of 0.2 μM in each primer and 6.6 μL of ultrapure water (UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water, Catalog number: 10977015-Invitrogen) and 1 μL of genomic DNA with a concentration of 10 ng.

Amplification was performed in an Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient Thermal Cyclers Cole-Parmer^® USA. The PCR reaction was carried out following a program lasting approximately 2 hours. The thermal profile consisted of an initial denaturation at 95 °C for 2 minutes, followed by 35 cycles consisting of: denaturation at 95 °C for 30 seconds, hybridization at 55 °C for 1 minute, and extension at 72 °C for 45 seconds. Finally, a final extension was performed at 72 °C for 10 minutes to complete the synthesis of the amplified fragments.

Separation of PCR products: the amplified products were analyzed by electrophoresis on a 1.5 % agarose gel prepared with GelRed™ (Biotium) as an intercalating agent. The run was performed in 0.5X TBE buffer at 100 V for approximately 2 hours. The 1Kb DNA Ladder molecular weight markers, INVITROGEN^®, was used.

Visualization of PCR products: visualization and analysis of the amplified DNA fragments was performed by photography, using the BIO-RAD ChemiDoc MP Imaging System Universal Hood III Photodocumenter, USA.

Results and Discussion

The DNA from the 62 C. purpureus accessions and the controls U. decumbens and U. ruziziensis were amplified with the ITS1/ITS4 primers. The amplification products revealed, in most samples, a clear polymorphic band in the gels. However, in some cases amplification of double bands could be observed in accessions 6, 28, 31, 42, 47, 49, 51, 52, 59 and 61 as well as weak bands in accessions 29, 30, 46, 50 and 53 or diffuse bands in accessions 5, 17, 32, 40, 47 and 49. The amplified fragments had an approximate size of 850 bp in Urochloa spp and 1000 bp in the C. purpureus accessions (figure 1).

The molecular differences, between species and genera, found in this study are in agreement with Ghosh et al. (2017)Ghosh, J. S., Bhattacharya, S. & Pal, A. 2017. Molecular phylogeny of 21 tropical bamboo species reconstructed by integrating non-coding internal transcribed spacer (ITS1 and 2) sequences and their consensus secondary structure. Genetica, 145(3): 319-333, ISSN: 1573-6857. https://doi.org/10.1007/s10709-017-9967-9. , who state that ITS are considered a useful source of characters for the identification of different groups of Angiosperm plants, since they generate important polymorphisms within the same taxonomic entity, particularly for genus and species. Also, the ITS region does not encode amino acids and therefore are subject to high variability due to its ubiquitous nature, rapid evolution, high representation in the genome, and the ability to be amplified with minimal amounts of DNA.

The amplification of 1000 and 850 bp ITS primers in C. purpureus and Urochloa spp. respectively, differ from those reported by Baldwin et al. (1995)Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F., Campbell, C.S. & Donoghue, M.J. 1995. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2): 247-277, ISSN: 2162-4372. https://www.jstor.org/stable/2399880. who stated that the ITS region is small and uniform in flowering plants and its total length is between 600 and 700 bp. In contrast, Liston et al. (1996)Liston, A., Robinson, W.A., Oliphant, J.M. & Álvarez-Buylla, E.R. 1996. Length variation in the nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacers of non-flowering seed plants. Systematic Botany, 21(2): 109-120, ISSN: 1548-2324. https://doi.org/10.2307/2419742. describe shorter lengths of this region for Angiosperms, ranging from 565 to 700 bp; in contrast, the ITS region of gymnosperms is considerably longer and has a greater range of variation, from 750 to 3125 bp.

Studies of the ITS region in the species C. purpureus, U. decumbens and U. ruziziensis are scarce. However, Chen et al. (2010)Chen, Z.T., Huang, Q.L., Pan, W.B. & Huang, Y.B. 2010. Sequence analysis of the rDNA ITS region of Pennisetum species (Poaceae). Acta Prataculturae Sinica, 19(4): 135, ISSN: 1004-5759. http://cyxb.magtech.com.cn/EN/Y2010/V19/I4/135. in a research on 15 species of the Cenchrus genus from areas such as Fujian, Jiangsu and Hainan in China, reported amplification of 573 to 586 bp for C. purpureus x C. americanus hybrids. In addition, in the species C. americanus 2n=2x=14 chromosomes and AA genome, genetically homologous to C. purpureus 2n=4x=28 chromosomes and A'A'BB genome, Almutairi (2021)Almutairi, Z.M. 2021. Molecular identification and phylogenetics of local pearl millet cultivars using internal-transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 19(4): 339-346, ISSN: 1479-2621. https://doi.org/10.1017/S1479262121000393. found a length of 772 to 774 bp for the amplification of the ITS region, in a study of six local cultivars of pearl millet from Saudi Arabia and their similarity to 31 accessions from India and France.

On the other hand, in a molecular phylogenetic study in 22 species from Urochloa genus it was determined that the amplification of the ITS region varied from 582 bp in U. decumbens, to 587 bp in Urochloa eruciformis (Sm.) Nelson & Fern. Casas, Urochloa xantholeuca (Hack. ex Schinz) H. Scholz, U. ruziziensis, and Urochloa mosambicensis (Hack.) Dandy (González and Morton 2005González, A.T. & Morton, C.M. 2005. Molecular and morphological phylogenetic analysis of Brachiaria and Urochloa (Poaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 37(1): 36-44, ISSN: 1095-9513. https://doi:10.1016/j.ympev.2005.06.003. ).

The results regarding base pair number in C. purpureus and Urochloa spp. can be explained according to those reported by Baldwin et al. (1995)Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F., Campbell, C.S. & Donoghue, M.J. 1995. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2): 247-277, ISSN: 2162-4372. https://www.jstor.org/stable/2399880. , who stated that approximately 300 bp is estimated for each ITS spacer, but depending on the plant family, ITS 1 may be larger or smaller and potentially more informative. Thus, Bult and Zimmer (1993)Bult, C. & Zimmer, E. 1993. Nuclear ribosomal RNA seguences for inferring tribal relationships within Onagraceae. Systematic Botany, 18(1): 48-63, ISSN: 1548-2324. https://www.jstor.org/stable/2419787. indicated that ITS spacers are more variable compared to the coding regions that are conserved in the genome.

The variability in the amplification of the ITS region in Angiosperms, compared to the results obtained in C. purpureus and Urochloa spp., can be observed in other species of Poaceae such as the study carried out by Hsiao et al. (1995)Hsiao, C., Chatterton, N. J., Asay, K. H. & Jensen, K. B. 1995. Molecular phylogeny of the Pooideae (Poaceae) based on nuclear rDNA (ITS) sequences. Theoretical and Applied Genetics, 90: 389-398, ISSN: 1432-2242. https://doi.org/10.1007/BF00221981. in 26 species of grasses. In the research, the authors found that the ITS region ranged from 585 to 602 bp among the tribes Oryzeae, Aveneae, Brachypodieae, Bromeae, Meliceae, Poeae, Stipeae, and Triticeae.

Also, Hsiao et al. (1998)Hsiao, C., Jacobs, S.W.L., Chatterton, N.J. & Asay, K.H. 1998. A molecular phylogeny of the grass family (Poaceae) based on the sequences of nuclear ribosomal DNA (ITS). Australian Systematic Botany, 11(6): 667-688, ISSN: 1446-5701. https://doi.org/10.1071/SB97012. continued the study and expanded the sample to 200 grass species. The results of the study revealed variations ranging from 584 to 633 bp for the ITS region in six subfamilies: Bambusoideae, Pooideae, Arundinoideae, Centothecoideae, Chloridoideae, and Panicoideae. Both researchers showed differences in this region in Poaceae and confirmed its ubiquitous nature in the plant genome.

The ITS markers have bi-paternal inheritance, allowing to reveal cases of hybridization and polyploidy in genera and species of Poaceae (Wang et al. 2022Wang, J., Yan, Z., Zhong, P., Shen, Z., Yang, G. & Ma, L. 2022. Screening of universal DNA barcodes for identifying grass species of Gramineae. Frontiers in Plant Science, 13: 998863, ISSN: 1664-462X. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.998863.). However, in C. purpureus and Urochloa spp the ITS1/ITS4 primers did not has polymorphic bands, which did not allow a clear determination of the genetic diversity between accessions of the same taxonomic entity. Furthermore, there were not differences in the C. purpureus x C. americanus hybrids that are in the germplasm under study. These results may be due to the need to include other primer pairs that complement those used or to genome sequencing, as indicated by Hsiao et al. (1998)Hsiao, C., Jacobs, S.W.L., Chatterton, N.J. & Asay, K.H. 1998. A molecular phylogeny of the grass family (Poaceae) based on the sequences of nuclear ribosomal DNA (ITS). Australian Systematic Botany, 11(6): 667-688, ISSN: 1446-5701. https://doi.org/10.1071/SB97012. , who observed that the use of different primer combinations (ITS1/ITS4, ITS1/ITS2 and ITS3/ITS4) allowed determining the variability of nuclear ribosomal DNA among Poaceae species.

This contradicts what referred by Ahmadi et al. (2022)Ahmadi, H., Solouki, M., Fazeli-Nasab, B., Heidari, F. & Sayyed, R.Z. 2022. Internal transcribed spacer (ITS) regions: A powerful tool for analysis of the diversity of wheat genotypes. Indian Journal of Experimental Biology, 60(2): 137-143, ISSN: 0975-1009. http://op.niscair.res.in/index.php/IJEB/article/view/34886. , who stated that ITS markers can be used as a more appropriate assessment tool to analyze interspecific and intraspecific relations when distinguishing different genotypes, since nucleotide changes decrease as evolution progresses, so that only a few nucleotide changes occur. In this sense, the results obtained in this study show that the ITS are more effective in identifying variability between species of different genera and are not efficient in determining genetic differences between accessions of the same species.

The amplification products of C. purpureus revealed, in some cases, the presence of double, weak or diffuse bands. González (2002)González, A.C. 2002. Detección del polimorfismo genético mediante marcadores bioquímicos en plantas. En: Marcadores moleculares: nuevos horizontes en la genética y la selección de las plantas. Cornide, M. T. (Coord.). Ed. Félix Varela, La Habana, Cuba. pp. 36-63. ISBN: 959-258-351-X. and Nadeem et al. (2018)Nadeem, M.A., Nawaz, M.A., Shahid, M.Q., Doğan, Y., Comertpay, G., Yıldız, M., Hatipoğlu, R., Ahmad, F., Alsaleh, A., Labhane, N., Özkan, H., Chung, G. & Baloch, F.S. 2018. DNA molecular markers in plant breeding: current status and recent advancements in genomic selection and genome editing. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 32(2): 261-285, ISSN: 1310-2818. https://doi.org/10.1080/13102818.2017.1400401. report that these characteristics in the amplification of the band patterns could be due to the composition of the gel and the buffer, as well as the voltage and current intensity conditions. In addition, some of the primers used may have more than one hybridization region in the genomic DNA of the studied samples, the presence of introns in the rDNA subunits, and the amplification technique or amplification of DNA from external contamination. So, it is necessary to check the influence of these factors on the amplification of ITS primers in subsequent assays.

Conclusions

It is concluded that the ITS1/ITS4 primers are effective in amplifying DNA from C. purpureus and Urochloa spp. accessions, demonstrating their usefulness as a tool for evaluating the quality of the extracted DNA and its amplification capacity by PCR. However, these primers do not have sufficient resolution to distinguish genetic differences between accessions of both species within the fragment of the ITS region analyzed.

Although ITS markers can be used to verify the amplification of C. purpureus samples and for general differentiation between species of the genus in the Poaceae family, it is recommended to complement these analyses with sequencing techniques to achieve a more precise genetic characterization.

The information generated in this study expands the genetic-molecular knowledge of C. purpureus and creates the initial conditions for future phylogenetic studies in the genus Cenchrus, as well as for the application of assisted selection strategies in improvement and conservation programs for its germplasm.

Introducción

Cenchrus purpureus (Schumach.) Morrone con anterioridad Pennisetum purpureum, es una de las gramíneas forrajeras más relevantes en sistemas ganaderos tropicales y se destaca su empleo en la alimentación de rumiantes mediante el corte o pastoreo. Además, se reportan otros usos como planta ornamental y medicinal, en la industria se emplea su fibra para la fabricación de papel y como biocombustible (Nguyen et al. 2021Nguyen, B.T., Le, L.B., Pham, L.P., Nguyen, H.T., Tran, T.D. & Van Thai, N. 2021. The effects of biochar on the biomass yield of elephant grass (Pennisetum purpureum Schumach) and properties of acidic soils. Industrial Crops and Products, 161: 113224, ISSN: 1872-633X. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.113224. , Tan et al. 2022Tan, F., He, L., Zhu, Q., Wang, Y., Chen, C. & He, M. 2022. Pennisetum hydridum: a potential energy crop with multiple functions and the current status in China. BioEnergy Research, 15: 850-862, ISSN: 1939-1242. https://doi.org/10.1007/s12155-021-10263-7., Wessapak et al. 2023Wessapak, P., Ngernsaengsaruay, C. & Duangjai, S. 2023. A taxonomic revision of Cenchrus L. (Poaceae) in Thailand, with lectotypification of Pennisetum macrostachyum Benth. PhytoKeys, 234: 1-33, ISSN: 1314-2003. https://doi.org/10.3897/phytokeys.234.106486. y POWO 2025POWO. 2025. Plants of the World Online. Kew Royal Botanic Gardens. Available at: https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:77106033-1. [Consulted: January 03, 2025].).

En el Instituto de Ciencia Animal (ICA) de la República de Cuba, se conservan accesiones de C. purpureus desarrolladas mediante el programa de mejoramiento genético de este género orientado a incrementar la producción de biomasa, calidad nutricional y tolerancia a estreses abióticos como la salinidad y sequía (Herrera 2022Herrera, R.S. 2022. Evaluation of Cenchrus purpureus varieties tolerant to drought in the western region of Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 56(2): 135-143, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/1049. , Fortes et al. 2023Fortes, D., Herrera, R.S. & Herrera, M. 2023. Morphoagronomic performance of Cenchrus purpureus new clones. Cuban Journal of Agricultural Science, 57: 8, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/1105. y Álvarez et al. 2024Álvarez, Y., Herrera, R.S., Ramírez, J.L., Verdecia, D.M., Benítez, D. & López, S. 2024. Performance of Cenchrus purpureus varieties tolerant to salinity under the edaphoclimatic conditions of Granma province, Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 58: e01, ISSN: 2079-3480. https://cu-id.com/1996/v58e01. ). Esta colección se evaluó en cuanto a producción de forraje y respuesta al pastoreo mediante indicadores morfológicos y de calidad (Herrera et al. 2019Herrera, R., García, M. & Cruz, A.M. 2019. Study of morphoagronomic indicators of Cenchrus purpureus clones for biomass production. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 189-196, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/886. ) y marcadores moleculares como las isoenzimas, la Secuencia Simple Repetida (SSR) y regiones entre secuencias simples repetidas (ISSR) (Cruz et al. 1993Cruz, R., Sosa, A., Herrera, R.S. & Martínez, R.O. 1993. Identificación electroforética de Pennisetum purpureum cv. King grass. Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 27(2): 219-223, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS. , González y Martínez 2019González, C. & Martínez, R.O. 2019. Genetic characterization of clones and varieties of Cenchrus purpureus with microsatellite markers. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 307-318, ISSN: 2079-3480. https://cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/914. y Álvarez 2021Álvarez Báez, Y. 2021. Comportamiento productivo de nuevas variedades de Cenchrus purpureus en el Valle del Cauto, Cuba. Tesis de Doctorado. Universidad de Granma. Cuba. p. 99.).

Los marcadores moleculares son herramientas fundamentales para caracterizar la diversidad genética, optimizar la conservación de germoplasma y diseñar estrategias de selección asistida (Özbek 2024Özbek, Ö. 2024. Molecular Markers Used to Reveal Genetic Diversity and Phylogenetic Relationships in Crop Plants. OBM Genetics, 8(4): 1-25, ISSN: 2577-5790. https://doi.org/10.21926/obm.genet.2404274.). En la actualidad existen cebadore específicos para estudiar la diversidad genética en plantas como son los marcadores de código de barras de ADN vegetal rbcL y matK los cuales se emplean en estudios filogenéticos en plantas con flores y coníferas (de Vere et al. 2012de Vere. N., Rich, T.C.G., Ford, C.R., Trinder, S.A., Long, C., Moore, C.W., Satterthwaite, D., Davies, H., Allainguillaume, J., Ronca, S., Tatarinova, T. Garbett, H., Walker, K. & Wilkinson, M.J. 2012. DNA Barcoding the Native Flowering Plants and Conifers of Wales. PLoS ONE, 7(6): e37945, ISSN: 1932-6203. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0037945. y Jones et al. 2021Jones, L., Twyford, A.D., Ford, C.R., Rich, T.C., Davies, H., Forrest, L.L., Hart, M.L., McHaffie, H., Brown, M.R., Hollingsworth, P.M. & De Vere, N. 2021. Barcode UK: A complete DNA barcoding resource for the flowering plants and conifers of the United Kingdom. Molecular Ecology Resources, 21(6): 2050-2062. ISSN: 1755-0998. https://doi.org/10.1111/1755-0998.13388. ). Sin embargo, existen otros marcadores obtenidos de la región ITS (Internal Transcribed Spacer) del ADN ribosomal nuclearse, que destacan por su utilidad en la identificación de diferentes niveles evolutivos como son los hongos, bacterias y plantas, en este último resalta su empleo en estudios filogenéticos a nivel de género y especie debido a su alta tasa de sustitución nucleotídica y amplia disponibilidad en bases de datos (Alaklabi 2021Alaklabi, A. 2021. Ficus Species Genetic Diversity Based on Internal Transcribed Spacer (ITS) Region Analysis. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, H. Botany, 12(1): 21-27, ISSN: 2090-3820. https://doi.org/10.21608/eajbsh.2021.148134. ).

En Poaceae, esta región ha esclarecido relaciones taxonómicas en géneros como Sorghum (Sun et al. 1994Sun, Y., Skinner, D.Z., Liang, G.H. & Hulbert, S.H. 1994. Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Theoretical and Applied Genetics, 89: 26-32, ISSN: 1432-2242. https://doi.org/10.1007/BF00226978.), Urochloa (González y Morton 2005González, A.T. & Morton, C.M. 2005. Molecular and morphological phylogenetic analysis of Brachiaria and Urochloa (Poaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 37(1): 36-44, ISSN: 1095-9513. https://doi:10.1016/j.ympev.2005.06.003. ), Chloris (Liao et al. 2020Liao, H.C., Ming-Hui, C. & Chih-Hui, C. 2020. Barcode of nuclear ribosomal internal transcribed spacer regions (ITS) as a useful tool to recognize a newly naturalized and potentially invasive weed, Chloris pilosa Schumach. (Poaceae), in Taiwan. Taiwania, 65(2): 129, ISSN: 0372-333X. https://doi.org/10.6165/tai.2020.65.129. ), Phalaris (Al Rahbawi et al. 2021Al Rahbawi, S.M., Al-Edhari, A.H. & Sardar, A.S. 2021. Phylogenetic Study of the Genus Phalaris L. (Poaceae) based on Nuclear Internal Transcript Region (ITS) in Iraq. Annals of the Romanian Society for Cell Biology, 25(3): 8278-8281, ISSN: 2067-8282. http://annalsofrscb.ro/index.php/journal/article/view/2368. ) y la especie Cenchrus americanus (L.) Morrone (Almutairi 2021Almutairi, Z.M. 2021. Molecular identification and phylogenetics of local pearl millet cultivars using internal-transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 19(4): 339-346, ISSN: 1479-2621. https://doi.org/10.1017/S1479262121000393. ). Sin embargo, no se informan estudios, en la literatura consultada, donde se utilicen los cebadores ITS en C. purpureus, lo cual limita su información genómica, lo que a su vez restringe su aplicación en estudios filogenéticos y de diversidad intraespecífica, y su manejo en programas de mejoramiento genético.

En Cuba, los estudios mediante marcadores moleculares en C. purpureus son escasos y se han centrado en marcadores tradicionales, limitando la comprensión de su diversidad genómica. Por ello, este estudio tuvo el objetivo de identificar un fragmento de la región ITS utilizando los cebadores universales ITS1/ITS4 en C. purpureus y contribuir al conocimiento genético-molecular para futuros análisis filogenéticos y de selección asistida.

Materiales y Métodos

La presente investigación se realizó en el Laboratorio de ADN, perteneciente al edificio de Semillas del Futuro, en la Alianza de Bioversity International y el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Valle del Cauca, Colombia.

Material vegetal: las muestras en estudio se obtuvieron de 62 accesiones de C. purpureus, con similar edad de rebrote y condiciones de cultivo, conservadas en del banco de germoplasma de pastos y forrajes, perteneciente al Centro Experimental de Pastos y Forrajes Miguel Sistachs Naya del Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, ubicado en los 22º 53 LN y los 82º 02 LO a 80 m.s.n.m. Adicionalmente, se incluyeron dos muestras de Urochloa decumbens (Stapf) R. D. Webster - CIAT 606 y Urochloa ruziziensis (R. Germ. & C. M. Evrard) Crins - CIAT 6713 del Programa de Recursos Genéticos de la Alianza de Bioversity International y el Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia.

Extracción y amplificaciones del ADN: para la extracción del ADN genómico se utilizó el método MATAB (Risterucci et al. 2000Risterucci, A., Grivet, L., N’Goran, Pieretti, J., Flament, M. & Lanaud, C. 2000. A high-density linkage map of Theobroma cacao L. Theoretical and Applied Genetics, 101: 948-955, ISSN: 0040-5752. https://doi.org/10.1007/s001220051566.) modificado. La amplificación del ADN se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con la combinación de cebadores directo e inverso ITS1/ITS4 descritos por White et al. 1990White, T. J., Bruns, T., Lee, S.J.W.T. & Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: a guide tomethods and applications. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky & T. White (eds.). Academic Press, INC. San Diego California. pp. 315-322. ISBN: 0-12-372181-4. (tabla 1).

La mezcla para la PCR se realizó en un volumen final de 12 μL, utilizando 4 µL de buffer 2X Promega (GoTaq^® Green Master Mix), 0,2 μL de ITS1 e ITS4, con una concentración final 0,2 µM en cada cebador y 6,6 μL de agua ultrapura (UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water, Catalog number: 10977015-Invitrogen) y 1 μL de ADN genómico con una concentración de 10 ng.

La amplificación se realizó en un termociclador Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient Thermal Cyclers Cole-Parmer^® USA. La reacción de PCR se llevó a cabo siguiendo un programa de aproximadamente 2 horas de duración. El perfil térmico consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 minutos, seguida de 35 ciclos compuestos por: desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 1 minuto y extensión a 72 °C durante 45 segundos. Finalmente, se realizó una extensión final a 72 °C durante 10 minutos para completar la síntesis de los fragmentos amplificados.

Separación de los productos de PCR: los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % preparado con GelRed™ (Biotium) como agente intercalante. La corrida se realizó en tampón TBE 0.5X a 100 V durante aproximadamente 2 horas. Se utilizó el marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder, INVITROGEN^®.

Visualización de los productos de PCR: la visualización y análisis de los fragmentos amplificados de ADN se realizó mediante fotografía, con el Fotodocumentador BIO-RAD ChemiDoc MP Imaging System Universal Hood III, USA.

Resultados y Discusión

El ADN de las 62 accesiones de C. purpureus y las muestras de U. decumbens y U. ruziziensis, amplificaron con los cebadores ITS1/ITS4. Los productos de amplificación revelaron, en la mayoría de las muestras, una banda polimórfica nítida en los geles. Sin embargo, en algunos casos se pudo observar amplificación de bandas dobles en las accesiones 6, 28, 31, 42, 47, 49, 51, 52, 59 y 61 así como bandas débiles en las accesiones 29, 30, 46, 50 y 53 o difusas en las accesiones 5, 17, 32, 40, 47 y 49. Los fragmentos amplificados presentaron un tamaño aproximado de 850 pb en Urochloa spp y 1000 pb en las accesiones de C. purpureus (figura 1).

Las diferencias moleculares, entre especies y géneros, que se halló en el presente estudio están de acuerdo con Ghosh et al. (2017)Ghosh, J. S., Bhattacharya, S. & Pal, A. 2017. Molecular phylogeny of 21 tropical bamboo species reconstructed by integrating non-coding internal transcribed spacer (ITS1 and 2) sequences and their consensus secondary structure. Genetica, 145(3): 319-333, ISSN: 1573-6857. https://doi.org/10.1007/s10709-017-9967-9. , los cuales afirman que los ITS se consideran como fuente útil de caracteres para la identificación de diferentes grupos de plantas Angiospermas, ya que generan importantes polimorfismos dentro de la misma entidad taxonómica, en particular para género y especie. Además, la región ITS no es codificante de aminoácidos y por lo tanto están sujetas a elevada variabilidad, debido a su naturaleza ubicua, rápida evolución, se encuentran altamente representadas en el genoma y se pueden amplificar con cantidades mínimas de ADN.

La amplificación de 1000 y 850 pb de los cebadores ITS en C. purpureus y Urochloa spp. respectivamente, difieren a lo referido por Baldwin et al. (1995)Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F., Campbell, C.S. & Donoghue, M.J. 1995. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2): 247-277, ISSN: 2162-4372. https://www.jstor.org/stable/2399880. los cuales plantearon que la región ITS es pequeña y uniforme en las plantas con flores y su longitud total se encuentra entre 600 a 700 bp. Por el contrario, Liston et al. (1996)Liston, A., Robinson, W.A., Oliphant, J.M. & Álvarez-Buylla, E.R. 1996. Length variation in the nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacers of non-flowering seed plants. Systematic Botany, 21(2): 109-120, ISSN: 1548-2324. https://doi.org/10.2307/2419742. , describen longitudes menores de esta región para las Angiospermas se encuentran entre 565 y 700 bp, en contraste, la región de los ITS de gimnospermas es considerablemente más larga y tiene un mayor rango de variación que va desde 750 hasta 3125 bp.

Los estudios de la región ITS en las especies C. purpureus, U. decumbens y U. ruziziensis son escasos. Sin embargo, Chen et al. (2010)Chen, Z.T., Huang, Q.L., Pan, W.B. & Huang, Y.B. 2010. Sequence analysis of the rDNA ITS region of Pennisetum species (Poaceae). Acta Prataculturae Sinica, 19(4): 135, ISSN: 1004-5759. http://cyxb.magtech.com.cn/EN/Y2010/V19/I4/135. en una investigación en 15 especies del género Cenchrus de zonas como Fujian, Jiangsu y Hainan en China, reportaron amplificación de 573 a 586 pb para los híbridos de C. purpureus x C. americanus. Además, en la especie C. americanus 2n=2x=14 cromosomas y genoma AA, genéticamente homóloga a C. purpureus 2n=4x=28 cromosomas y genoma A'A'BB, Almutairi (2021)Almutairi, Z.M. 2021. Molecular identification and phylogenetics of local pearl millet cultivars using internal-transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 19(4): 339-346, ISSN: 1479-2621. https://doi.org/10.1017/S1479262121000393. halló una longitud de 772 a 774 pb para la amplificación de la región ITS, en un estudio de seis cultivares locales de millo perla de Arabia Saudí y su semejanza con 31 accesiones de India y Francia.

Por otra parte, en un estudio filogenético molecular en 22 especies del género Urochloa se determinó que la amplificación de la región ITS varió de 582 pb en U. decumbens, a 587 pb en Urochloa eruciformis (Sm.) Nelson & Fern. Casas, Urochloa xantholeuca (Hack. ex Schinz) H. Scholz, U. ruziziensis, y Urochloa mosambicensis (Hack.) Dandy (González y Morton 2005González, A.T. & Morton, C.M. 2005. Molecular and morphological phylogenetic analysis of Brachiaria and Urochloa (Poaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 37(1): 36-44, ISSN: 1095-9513. https://doi:10.1016/j.ympev.2005.06.003. ). Los resultados en cuanto a número de pares de bases en C. purpureus y en Urochloa spp. se pueden explicar según lo informado por Baldwin et al. (1995)Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F., Campbell, C.S. & Donoghue, M.J. 1995. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2): 247-277, ISSN: 2162-4372. https://www.jstor.org/stable/2399880. , los cuales expusieron que se calcula aproximadamente 300 bp por cada espaciador ITS, pero dependiendo de la familia de plantas, ITS 1 puede ser mayor o menor y potencialmente más informativo. Por lo que, Bult y Zimmer (1993)Bult, C. & Zimmer, E. 1993. Nuclear ribosomal RNA seguences for inferring tribal relationships within Onagraceae. Systematic Botany, 18(1): 48-63, ISSN: 1548-2324. https://www.jstor.org/stable/2419787. indicaron que los espaciadores ITS son más variables en comparación con las regiones codificadoras que están conservadas en el genoma.

La variabilidad en la amplificación de la región ITS en las Angiospermas, en comparación con los resultados obtenidos en C. purpureus y en Urochloa spp., se puede observar en otras especies de Poaceae como el estudio realizado por Hsiao et al. (1995)Hsiao, C., Chatterton, N. J., Asay, K. H. & Jensen, K. B. 1995. Molecular phylogeny of the Pooideae (Poaceae) based on nuclear rDNA (ITS) sequences. Theoretical and Applied Genetics, 90: 389-398, ISSN: 1432-2242. https://doi.org/10.1007/BF00221981. en 26 especies de gramíneas. En la investigación los autores hallaron que la región ITS varió de 585 a 602 bp entre las tribus Oryzeae, Aveneae, Brachypodieae, Bromeae, Meliceae, Poeae, Stipeae y Triticeae.

Además, Hsiao et al. (1998)Hsiao, C., Jacobs, S.W.L., Chatterton, N.J. & Asay, K.H. 1998. A molecular phylogeny of the grass family (Poaceae) based on the sequences of nuclear ribosomal DNA (ITS). Australian Systematic Botany, 11(6): 667-688, ISSN: 1446-5701. https://doi.org/10.1071/SB97012. continuaron el estudio y ampliaron la muestra a 200 especies de gramíneas. Los resultados del trabajo revelaron variaciones de 584 a 633 pb para la región ITS en seis subfamilias Bambusoideae, Pooideae, Arundinoideae, Centothecoideae, Chloridoideae y Panicoideae. En ambas investigaciones se evidenciaron las diferencias de esta región en Poaceae y confirmaron el carácter ubicuo en el genoma vegetal.

Los marcadores ITS tienen herencia bi-paterna, lo que permite revelar casos de hibridación y poliploidía en géneros y especies de Poaceae (Wang et al. 2022Wang, J., Yan, Z., Zhong, P., Shen, Z., Yang, G. & Ma, L. 2022. Screening of universal DNA barcodes for identifying grass species of Gramineae. Frontiers in Plant Science, 13: 998863, ISSN: 1664-462X. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.998863.). Sin embargo, en C. purpureus y en Urochloa spp los cebadores ITS1/ITS4 no presentaron bandas polimórficas lo que no permitió determinar con claridad la diversidad genética entre accesiones de la misma entidad taxonómica. Además, no se pudo observar diferencias en cuanto a los híbridos de C. purpureus x C. americanus que están presentes en el germoplasma en estudio. Estos resultados se pueden deber a que es necesario la inclusión de otros pares de iniciadores que complementen a los utilizados o la secuenciación del genoma, como indicaron Hsiao et al. (1998)Hsiao, C., Jacobs, S.W.L., Chatterton, N.J. & Asay, K.H. 1998. A molecular phylogeny of the grass family (Poaceae) based on the sequences of nuclear ribosomal DNA (ITS). Australian Systematic Botany, 11(6): 667-688, ISSN: 1446-5701. https://doi.org/10.1071/SB97012. los cuales observaron que la utilización de diferentes combinaciones de iniciadores (ITS1/ITS4, ITS1/ITS2 e ITS3/ITS4), permitieron determinar la variabilidad del ADN ribosómico nuclear entre las especies de Poaceae.

Esto contradice los resultados de Ahmadi et al. (2022)Ahmadi, H., Solouki, M., Fazeli-Nasab, B., Heidari, F. & Sayyed, R.Z. 2022. Internal transcribed spacer (ITS) regions: A powerful tool for analysis of the diversity of wheat genotypes. Indian Journal of Experimental Biology, 60(2): 137-143, ISSN: 0975-1009. http://op.niscair.res.in/index.php/IJEB/article/view/34886. , los cuales plantearon que los marcadores ITS pueden utilizarse como herramienta de evaluación más adecuada para analizar las relaciones interespecíficas e intraespecíficas en el momento de distinguir diferentes genotipos, ya que los cambios nucleotídicos disminuyen en la medida que avanza la evolución, de modo que solo se producen unos pocos cambios en los nucleótidos. En este sentido, los resultados obtenidos en el presente estudio indican que los ITS son más efectivos para identificar variabilidad entre especies de diferentes géneros y no son eficientes para determinar diferencias genéticas entre accesiones de la misma especie.

Los productos de amplificación de C. purpureus revelaron, en algunos casos presencia de bandas dobles, débiles o difusas. González (2002)González, A.C. 2002. Detección del polimorfismo genético mediante marcadores bioquímicos en plantas. En: Marcadores moleculares: nuevos horizontes en la genética y la selección de las plantas. Cornide, M. T. (Coord.). Ed. Félix Varela, La Habana, Cuba. pp. 36-63. ISBN: 959-258-351-X. y Nadeem et al. (2018)Nadeem, M.A., Nawaz, M.A., Shahid, M.Q., Doğan, Y., Comertpay, G., Yıldız, M., Hatipoğlu, R., Ahmad, F., Alsaleh, A., Labhane, N., Özkan, H., Chung, G. & Baloch, F.S. 2018. DNA molecular markers in plant breeding: current status and recent advancements in genomic selection and genome editing. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 32(2): 261-285, ISSN: 1310-2818. https://doi.org/10.1080/13102818.2017.1400401. , refieren que estas características en la amplificación de los patrones de bandas se pudieron deber a la composición del gel y el buffer, así como las condiciones de voltaje e intensidad de corriente. Además, de que algunos de los cebadores utilizados pueden tener más de una región de hibridación en el ADN genómico de las muestras estudiadas, la existencia de intrones en las subunidades del ADNr. y la técnica de amplificación o la amplificación de ADN procedente de alguna contaminación externa. Por lo que es necesario comprobar la influencia de estos factores en la amplificación de los cebadores ITS en ensayos posteriores.

Conclusiones

Se concluye que los cebadores ITS1/ITS4 son eficaces para amplificar el ADN de accesiones de C. purpureus y Urochloa spp., demostrando su utilidad como herramienta para evaluar la calidad del ADN extraído y su capacidad de amplificación mediante PCR. Sin embargo, estos cebadores no poseen la resolución suficiente para distinguir diferencias genéticas entre accesiones de ambas especies dentro del fragmento de la región ITS analizado.

Aunque los marcadores ITS pueden utilizarse para verificar la amplificación de muestras de C. purpureus y para la diferenciación general entre especies del género en la familia Poaceae, se recomienda complementar estos análisis con técnicas de secuenciación para lograr una caracterización genética más precisa.

La información generada en este estudio amplía el conocimiento genético-molecular de C. purpureus y crea las condiciones iniciales para futuros estudios filogenéticos en el género Cenchrus, así como para la aplicación de estrategias de selección asistida en programas de mejoramiento y conservación de su germoplasma.