Chemical characterization of Tithonia diversifolia forage meal

For the study of the chemical composition a total of 1 kg of forage meal at a 1mm particle size was milled and stored in amber bottles until the moment of the analysis. The analysis of the chemical composition indicators was performed by sextuplicate.

The bromatological analysis was performed to determine the dry matter (DM), crude protein (CP) and ashes (A) according to AOAC (2019)AOAC Official Methods of Analysis. Association of Analytical Chemists. 2019. 21st Edition, Washington DC, USA.. The Ca was quantified in atomic absorption equipment. The phosphorous determination (P) was performed according to Amaral (1972)Amaral, A. 1972. Técnicas analíticas para evaluar macro nutrientes en cenizas de caña de azúcar. Laboratorio de nutrición de la caña. Escuela de Química. Universidad de La Habana, Cuba. methodology. The cell wall components were also analyzed. The neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), lignin (Lig) and cellulose (Cel) were determined according to the procedures described by Göering and VanSoest (1970)Göering, H.K. & Van Soest, P.J. 1970. Forage fiber analyses (apparatus, reagents, procedures, and some applications). USDA - ARS Agric. Handbook. Washington: US Govt. Printying Office. p 20.. Also, the phytochemical sieves tests were performed to the plant material 10 forage meal according to Miranda and Cuellar (2000)Miranda, M. & Cuéllar, A. 2000. Manual de prácticas de laboratorio. Farmacognosia y productos naturales. Facultad de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana, 40pp. The presence of 12 functional groups was researched: alkaloids, saponins, triterpenes/steroids, tannins, proantocianidines, coumarines, quinines, reducing sugars, amine groups, resins and cardenolides. The total condensed tannins (TCT) were quantified according to the procedures of Porter et al. (1986) test, modified by Makkar (2003Makkar, H.P.S. 2003. Cuantification of tannins in tres and shrub foliage. A laboratory manual Kluber Academic Publisher. Netherlands, 102pp.).

Statistical analysis

A descriptive statistical analysis was carried out (mean, standard deviation and variation coefficient (%). For the analysis of results the statistical system Infostat (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., Gonzalez, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. Grupo InfoStat versión 2012. FCA Universidad Nacional de Córdoba Argentina. [En línea]. Available at: http://www.infostat.com.ar ) was used.

Animals and diets

A total of 40 male broilers of the Cuban hybrid EB₂₄ of 42 days old and 32 replacement pullets of laying hens White Leghorn L₃₃ of 18 weeks were used to evaluate the effect of tithonia intake on macroscopic morphometric indicators of digestive organs and accessories of the gastrointestinal tract of both. In the replacement pullets it was also performed a qualitative histopathologic evaluation and microscopic structural changes in digestive organs and accessories of the gastrointestinal tract. All the animals were from a productive performance experiment. The broilers were distributed in five inclusion treatments (0, 5, 10, 15 and 20 %) of plant material, while for the pullets were included four levels (0, 10, 15 and 20 %). The basic diet was soybean meal as protein source and corn as energy source. In all cases a total of eight repetitions per treatment were performed. During all the experimentation time the animals had free access to water and food.

The experimental diets were formulated according to the nutritional recommendations for broilers of Rostagno et al. (2017)Rostagno, H.S., Albino, L.F., Hannas, H.I., Donzele, J.L., Sakomura, N.K., Perazzo, F.G., Saraiva, A., Teixeira, M.V., Rodríguez, P.B., Oliveira, R.F., Barreto, S.L. & Brito, C.O. 2017. Tabelas brasileiras para aves e suínos: composição de alimentos e exigencias nutricionais. 4ta edição. Viçosa, MG: Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Viçosa. 488p., while for the pullets were fallow the UECAN (2013)Unión de Empresas del Combinado Avícola Nacional (UECAN). 2013. Instructivo técnico para la crianza del reemplazo de ponedoras White Leghorn, MINAG. recommendations. For the formulation of broilers diets, look Savón et al. (2022)Savón, L.L, Rodríguez, B., Vázquez, Y., Scull, I., Herrera, M. & Ruiz, T.E. 2022. Immune response and blood biochemistry in broilers fed tithonia forage meal at the finishing stage. Cuban Journal of Agricultural Science, 56(2): 127-134, ISSN: 2079-3480. and in the case of pullets look Vázquez et al. (2018).

Experimental procedure

At 42 days of age a total of 8 birds per treatment were weighed (total of animals 40), and at 18 weeks of age the replacement pullets of laying hens were weighed (total of animals 32), whose weights were corresponded with the average value of each treatment. The selection was made based on the average weight of each group of birds on a range of 10 % and the indicators that the following experimental procedure shows were determined.

Morphometric indicators of digestive organs and accessories

The birds were sacrificed two hours and thirty minutes after food ingestion, by the method of jugular vein bleeding, described by Sánchez (1990)Sánchez, A. 1990. Enfermedades de las aves. La Habana, Cuba: ENPES, 285 p.. Subsequently, the procedure described by Savón et al. (2021)Savón, L.L., Rodríguez, B., Elías, A^ϯ, Scull, I., Herrera, M & Ortega, H.J^ϯ. 2021. Evaluación biológica de un producto fermentado seco basado en contenido de rumen (Vitarrum) para la alimentación y salud avícola. (folleto). IBSN: 9789597171-85-0. was fallowed. The data of organs were expressed as absolute weight (g) and as relative weight (g g live weight^-1 100). The lengths of the small intestine, caeca and colon - rectum were measured with a tape measure.

Histopathologic evaluation

A total of 32 replacement pullets of laying hens were used and sacrificed according to that described by Savón et al. (2021)Savón, L.L., Rodríguez, B., Elías, A^ϯ, Scull, I., Herrera, M & Ortega, H.J^ϯ. 2021. Evaluación biológica de un producto fermentado seco basado en contenido de rumen (Vitarrum) para la alimentación y salud avícola. (folleto). IBSN: 9789597171-85-0. . For the microscopic test four 1cm² samples of proventriculus, gizzard, small intestine (ileum), caeca and liver were taken. The histopathologic evaluation was performed according to POT (05.22.016) in Pathology Laboratory of Toxicology Experimental Center (CETEX) from Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). A microscope Motic, BA410E was used for this.

Histological evaluation (quantitative)

The process start performing the observation of histological sheets with the optical microscope MoticBA410E.Then the corresponding images were taken with a camera for instant digital microscopy Motican 1080 BMH, with a resolution of 3 megapixels, in magnification of 40× and those images were analyzed with the software for images treatment Motic® Images plus 3.0 (Motic China Group Co.)

For the morphometric study of the histological cuts of the digestive system seven variables per animal were determined which were measured with the help of the software processing and analysis of images: in the proventriculus mucus height (µm), diameter of the glandular buds (µm); in the gizzard: mucus height (µm); in the small intestine: villi height (µm), villi width (µm), depth of Lieberkühn crypts (µm) and in the caeca: mucus height (µm).

Later, the images were filed in JPG format to keep all details observed in the microscope and after the variables were measured with the help of the software processing and analysis of images Motic. An area per variable and animal was counted.

Blood biochemistry indicators

The blood sample was directly taken from the jugular vein when the animals were slaughtered. A total of 40 male broilers and 32 replacement pullets were used (8 per treatment for both categories). In broilers were determined: cholesterol, glucose, triglycerides, total proteins, albumin and the enzymes alanine amino transferase, aspartate amino transferase and the uric acid. In the case of the replacement pullets were analyzed: total proteins, cholesterol, triglycerides and glucose. All determinations were performed on blood serum using a Cobas integra 400PLUS automatic analyzer (Roche Diagnostic System).

Experimental design and statistical analysis

The results of the morphometric experiment of broilers were analyzed according to a completely random design, the initial weight of animals was fitted as covariable. The data was processed with the statistical package InfoStat 2012 (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., Gonzalez, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. Grupo InfoStat versión 2012. FCA Universidad Nacional de Córdoba Argentina. [En línea]. Available at: http://www.infostat.com.ar ). For means comparison the Duncan (1955)Duncan, B. 1955. Multiple range and multiple F test. Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 1541-0420. https://doi.org/10.2307/3001478. test was used, for p<0.05, in the necessary cases.

For the experiment of macroscopic morphometric indicators of digestive organs and accessories of the gastrointestinal tract of replacement pullets of laying hens, the design and statistical analysis were similar to those used in broilers.

In the case of the microscopic morphometric evaluation of the structural changes in the digestive system organs the data obtained from the performed measurements were introduce in the statistical package Graphpad, version 8.1. From them the descriptive statistics for each analyzed indicator were determined. The normality was determined by the Kolmogorov-Smirnov test. corrected by Lilliefors (1967)Lilliefors, H.W. 1967. On the Kolmogorov-Smirnov Test for Normality with Mean and Variance Unknown. Journal of the American Statistical Association, 62(318): 399-402, ISSN: 1537-274X. http://doi.org/10.2307/2283970. The homogeneity of variances was determined by the Levene test (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. Stanford University Press. pp. 278-292.. When these premises were fulfilled, simple factorial Analysis of Variance (ANOVA) was performed taking into account the variable experimental group; using to determine the differences the Student test. When it was not fulfilled one or both premises (normality or homogeneity of variance), a non -parametric analysis was carried through the Kruskal-Wallis (1952)Kruskal, W.H. & Wallis, W.A. 1952. Use of ranks on one-criterion variance analysis. Journal of the American Statistical Association, 47: 583-621, ISSN: 1537-274X. http://dx.doi.org/10.1080/01621459.1952.10483441. test using to determine the differences the non parametric Dunn (1964)Dunn, O.J. 1964. Multiple comparation using rank Sums. Technometrics, 6(3): 241-252, ISSN: 1537-2723. https://doi.org/10.1080/004001706.1964.10490181. test. It was work for a signification level of p<0.05.

Chemical characterization and secondary metabolites of T. diversifolia plant material 10 forage meal

The thitonia plant material 10 forage meal showed a contribution of 24.6 % of crude protein, 20.3 % of ashes, 2.38 % of Ca, 36.07 % of neutral detergent fiber, 32.48 % of acid detergent fiber and 25.87 % of cellulose, which characterized it as an alternative protein source high in fiber.

The ashes content is an indicator of the proportion of inorganic compounds present in the plant. In this study the ashes levels were high, aspect that is in correspondence with the Ca high concentrations which were find and are related with previous studies (Fuentes-Martínez et al. 2019Fuentes-Martínez, B., Carranco-Jáuregui, M., Barrita-Ramírez, V., Ávila-González, E. & Sanginés-García, L. 2019. Effect of Tithonia diversifolia meal on productive e variables in laying hens. Abanico Veterinario, 9: 1-12, ISSN: 2007-428X. https://doi.org/10.21929/abavet2019.911 ). Despite, the insoluble fiber constituted the majority component of the meal, the values are within the specified for animal food and are lower to those reported by Savón (2010)Savón, L. 2010. Harina de forrajes tropicales. Fuentes potenciales para la alimentación de especies monogástricas. Tesis presentada en opción del grado científico de Dr. en Ciencias. Instituto de Ciencia Animal. Universidad Agraria de la Habana. for a group of tropical plants.

The nutritional value of a food depends among other factors, of the secondary metabolites presence. These compounds can have beneficial or anti-nutritional effects on the animal, depending on their concentration, chemical structure and bioavailability, as well as, the characteristics of the animal species (Scull 2018Scull, I. 2018. Caracterización química de la harina de forraje de Mucuna pruriens (L) DC vc utilis (Wallx Wight) L.H. Bailey y su evaluación como antioxidante natural para la alimentación animal. Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Veterinarias. Instituto de Ciencia Animal - Universidad de La Habana.). From the functional groups looked through the qualitative tests of the phytochemical sieve there were found low levels of alkaloids, phenolic compounds and triterpenes, metabolites that can provoke a marked biological activity in the animals.

González et al. (2019)González-Sierra, L., Díaz-Solares, M., Castro-Cabrera, I., Fonte-Carballo, L., Lugo-Morales, Y. & Altunaga-Pérez, N. 2019. Caracterización fitoquímica y actividad antioxidante total de diferentes extractos de Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray. Pastos y Forrajes, 42(3): 243-248, ISSN: 0864-0394. reported the presence of other secondary metabolites in the plant which there were not find in this study as: saponins, coumarines and quinines. This could be related with the insufficient concentration of these compounds in the meal for their effective detection with the used procedures. The above could be determined by changes in the metabolism of these compounds due to genetic differences and phenological state. The absence of saponins, coumarines and the low amounts of alkaloids and terpenes point to the phytochemical quality of the meal from this material as animal food. The secondary compounds essentially, can cause nutritional disorder, weight loose and gastrointestinal difficulties, when they are in high concentrations or are use in high proportions in the diet (Scull et al. 2017Scull, I., Savón, L.L., Hormaza, J.V. 2017. Evaluation of secondary metabolites in the meal of Stizolobium aterrimun forage for its use in animal feeding. Pastos y forrajes, 40(4): 302-307, ISSN: 2078-8452.).

The quantification of the proportions of phenolic compounds showed values of 9.83 and 3.85 g/kg of DM for total tannins (TT) and condensed tannins (CT), respectively refer to figures of total protein (TP) of 19.45 g/kg DM. The low concentration of CT, TT and TP corroborate the results of the phytochemical sieve and it is comparable with the values reported by García et al. (2008)García, D.E., Medina, M.G., Clavero, T., Humbría, J., Baldizán, A. & Domínguez, C.E. 2008. Preferencias de árboles forrajeros por cabras en las zonas bajas de los Andes venezolanos. Revista Científica, FCV-LUZ, XVIII(5): 549- 555, ISSN: 2521-9715. in trees and forage scrubs of use in animal feeding. Taking into account the above, this group of compounds should caused beneficial effects in the animal and influence positively in their biological activity. According to González-Sierra et al. (2019)González-Sierra, L., Díaz-Solares, M., Castro-Cabrera, I., Fonte-Carballo, L., Lugo-Morales, Y. & Altunaga-Pérez, N. 2019. Caracterización fitoquímica y actividad antioxidante total de diferentes extractos de Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray. Pastos y Forrajes, 42(3): 243-248, ISSN: 0864-0394., the antioxidant activity that T. diversifolia has is associated with the presence of flavonoids and other phenolic compounds present in the plant.

Macroscopic morphometric indicators of digestive organs and accessories of the gastrointestinal tract of broilers and replacement pullets of laying hens

Once the chemical composition and secondary metabolites presents in the Tithonia diversifolia plant material 10 forage meal were determined, the effect of this tree intake was evaluated on morphometric indicators of the gastrointestinal tract and accessories organs of the gastrointestinal tract of broilers and replacement pullets of laying hens.

In broilers, the relative weights of the empty gastrointestinal tract, full gizzard, empty small intestine and full colon-rectum were similar for all the experimental treatments (table 1). The above means that the intake of tithonia forage meal did not influence on the relative weights of these organs. In comparison, it was observed that the 20 % of this fibrous food caused an increase of the empty gizzard weight, which is associated with a great activity of the organ as result of the increasing amounts of insoluble fiber provide by the inclusion of tithonia in the diets (Jiménez-Moreno et al. 2010Jiménez-Moreno, E., González-Alvarado, J.M., González-Sánchez, D., Lázaro, R. & Mateos, G.G. 2010. Effects of type and particle size of dietary fiber on growth performance and digestive traits of broilers from 1 to 21 days of age. Poultry Science, 89(10): 2197-2212, ISSN: 1525-3171. https://doi.org/10.3382/ps.2010-00771. ).

The relative length of the small intestine of birds was similar for all the experimental treatments, with the exception of treatment 10% of tithonia forage meal that decrease with respect to levels of 15 and 20 % of substitution. Respect to the caeca, the relative length of the left caecum of the birds that intake the control diet, 5 and 10 % of inclusion of tithonia forage meal did not differ among them, but it increase with the levels 15 and 20 %. This is due to physiological response that is caused by the increase of the stay time of the fibrous particles in this organ, the action of the microbial mass and final products of fermentation. These sections inside the digestive tract are the only place where the fiber digestion takes place due to the fermentative activity the bacteria and cellulolytic fungi presents there has (Rodríguez et al. 2012Rodríguez, Z., Martínez, M., Sarmiento, L., Pérez, M., Dihigo, L.E., Núñez, O., Herrera, F.R. & Hernández, Y. 2012. Harina de forraje de Mucuna deeringiana en algunos grupos fisiológicos microbianos e indicadores fermentativos del ciego de pollos de ceba. Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 46(2): 193-198, ISSN: 0034-7485.). The magnitude of the response can be affected by the physiological composition of the fiber present in the diet (Savón 2010Savón, L. 2010. Harina de forrajes tropicales. Fuentes potenciales para la alimentación de especies monogástricas. Tesis presentada en opción del grado científico de Dr. en Ciencias. Instituto de Ciencia Animal. Universidad Agraria de la Habana.).

The intake of 20 % of tithonia forage meal caused an increase of the relative weight of the crop full and empty (table 2). The high intake of insoluble fiber provided by the tithonia forage meal increased the organ volume and alters their morphology.

The intake of tithonia forage meal did not influence on the relative weights of the full and empty proventriculus, the empty colon-rectum and the abdominal fat (tabla 2). Therefore, it was observed a significant increase of the relative weight of the full caeca, in relation with the control treatment with increasing fiber levels.

The above, it was not due to fermentative processes that occur in this section of the gastrointestinal tract, since the empty caecum did not showed differences among treatments. It is possible that the fiber contained in the digest, draw water in its organ and this cause the caeca contents increase. The relative length of the colon-rectum was similar. The analysis of the accessory organs of the gastrointestinal tract (liver and pancreas) did not showed differences among treatments.

Respect to the replacement pullets of laying hens, the inclusion of 15 and 20 % of tithonia forage meal increased the relative weight of the empty gastrointestinal tract of birds, which is associated with the increase of their digestive capacity when intake this bulky food (Savón et al. 2019Savón, L, Rodríguez, B., Vázquez, Y., Herrera, M. & Ruiz, T. 2019. Indicadores fisiológicos y de la bioquímica sanguínea de pollitas de reemplazo de ponedoras. Convención Internacional Agrodesarrollo, 25-29 octubre, Hotel Meliá Varadero, Matanzas, Cuba). These levels also increased the relative weight of the gizzard, similar effect which was previously observed in broilers.

An interesting result was obtained in the relative length of the small intestine (cm/g LW x100) which was increased with the levels of tithonia forage meal (8.89, 9.20, 9.59 and 10.43 for 0, 10, 15 and 20 %, respectively) (p<0.0515), very close of p<0.05. This show that there are differences from the biological point of view.

The length of the small intestine could be relate with surface of the intestinal mucus and an increase of this one involve a high nutrients absorption, which lead to good body development of the future laying hen (Savón et al. 2017Savón, L., Mora, L.M., Dihigo, L.E. & Ruiz, T.E. 2017. Use of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray in non-ruminants. CHAPTER XII En: Morera, Moringa y Tithonia in animal feeding and other interest uses results in Latin America, Cuba and the Caribbean. ISBN: 978-959-7171-72-0. ). This necessarily influence on the reproductive and productive response of the pullets. The length of the colon-rectum did not alter with the different levels of tithonia forage meal in the diet. The meal did not influence on the rest of the evaluated physiological indicators.

Effect of the tithonia forage meal intake on the histology of digestive organs and accessories of the gastrointestinal tract of replacement pullets of laying hens

In the case of replacement pullets due to the importance of this category, an histopathology study was performed with the purpose of research if the tithonia effect was able to cause a lesion at level of tissues of the digestive organs and accessories of this category.

The proventriculus, gizzard, caeca and liver were analyzed. It was observed that the changes find at level of tissues in the proventriculus, gizzard and liver were not attributable to the tithonia intake, since there were found also in the control animals

The most important find was identified in the caeca, where there was observed a moderate hypertrophy of the caecal tonsils which was in the treated animals and with an incidence of the 50, 25 and 12.5 % for the groups 2, 3 and 4, respectively.

The caecal tonsils are a specialized lymphoid tissue and their hypertrophy could be related with the supply of the plant material under study. These structures are exposing directly to the bolus during the digestion process, which has food, pathogen agents or vaccine. This allows the recognition of antigens with the production of effective immune responses in this level. The fact that the incidence of this change will be higher in the group supplied with the lower level of tithonia can be related with the individuality of the immune response of each individual. The above has great importance in the study of the immune response.

Quantitative structural evaluation of the morphometric changes in digestive organs of replacement pullets of laying hens, that intake T. diversifolia forage meal

The diet is one of the most important factors in the modulation of the structural and functional development of the intestine. The change of diet which the animal is faced is accompanied of modifications in the digestive and transportation functions with the characteristics of the mature organ are acquired. That is why it is important to perform a morphometric study of structures from the digestive system with the aim of quantify the changes associated to the administration of the diets with the inclusion of different levels of tithonia forage meal.

Table 3 shows the morphometric study of the values of the mean and standard deviation of each evaluated variable, per experimental group. There was only significant statistical differences in the width of the intestinal villi, between the control group and the supplied with the 20 % of tithonia meal (p=0.0153). This result possibly is associated to the supply of the higher concentration (20 %) of tithonia forage meal and it confirms the increase found in the length of the small intestine in the study of the macroscopic morphometric indicators.

Figure 1 shows the difference in ileum vili width between birds that received a control diet (A) based on maize/soya and those that include 20 % of tithonia forage meal in the diet (B).

The rest of the studied variables did not differ between treatments. It is important to highlight that although there was not significant statistical difference as to villi height and the dep of crypts between the experimental groups, the results show increase of the values as the concentration of food in the diet increase.

Indicators of the blood biochemistry in broilers and replacement pullets of laying hens that intake different level of T. diversifolia forage meal

The indicators of the blood biochemistry are resources which are use to evaluate the physiological state and consider the nutritional performance of the animal once it provide a knowledge of the metabolism and functioning of organs as the kidney and liver of birds (Gutiérrez-Castro y Corredor-Mateus 2019Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. ) and its determination is an important tool in the monitoring of the health of all species.

Table 4 shows indicators of blood biochemistry of 42-days-old broilers fed with different levels of tithonia forage meal.

The serum indicators of the protein metabolism: total proteins, albumin and albumin/globulin ratio did not differ between treatments, with the exception of the uric acid. Related to the total proteins are reported as normal values 30-50 g/L (Miranda et al. 2007Miranda, S., Rincón-Reyes, H., Muñoz, R., Higuera, A., Arzaillez-Fischer, A.M. & Urdaneta, H. 2007. Parámetros productivos y química sanguínea en pollos de engorde alimentados con tres niveles dietéticos de harina de granos de frijol (Vigna unguiculata) (i) Walp durante la fase de crecimiento. Revista Científica (Maracaibo), 17(2): 150-160, ISSN: 2521-9715. ) and 35.6 ± 0.34 g/L (Nunes et al. 2018Nunes, R.V., Broch, J., Wachholz, L, De Souza, C., Damasceno, J., Oxford, J.H., Bloxham D.J.L., Billard, L. & Pesti, G.M. 2018. Choosing sample sizes for various blood parameters of broiler chickens with normal and non-normal observations. Poultry Science, 97(2): 3746-3754, ISSN: 1525-3171. https://doi.org/10.3382/ps/pey217. ), while Café et al. (2012)Café, M., Pereira, F., Ribeiro, H., Bueno de Mattos, M., Mundim, A. & Prazeres, C. 2012. Biochemical blood parameters of broilers at different ages under thermoneutral environment. World`s Poultry Science Journal, Suppl. 1: 143-146, ISSN: 1743-4777. show figures of 26.5 g/L which are close to those obtained in this experiment. In this regard, the differences may be due to the influence of various factors such as the diets, breed and environmental conditions in which the experiments were carried out.

Albumin values were within the known range for this indicator (10.8-16 g/L), according to Gálvez et al. (2009)Gálvez, C.F., Ramírez, G.F. & Osorio, J.M. 2009. El laboratorio clínico en hematología de aves exóticas. Biosalud, 8(1): 178-188, ISSN: 2462-960X., which suggests that the studied tithonia forage meal levels did not affect the liver protein synthesis. Regarding globulins (taking into account that they are calculated as the difference between total proteins and albumin) were lower compared to those obtained by Gutiérrez-Castro and Corredor-Mateus (2019)Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. (17-20 g/L) with tithonia forage meal (does not specified if it is leaf or forage). Despite this, the albumin/globulin ratio is considered quite favorable and indicative that the birds were fine from a nutritional point of view, since it is close to which is the optimum ratio.

The serum uric acid depends on the quality as well as the quantity of protein supplied in the diet. The highest figure was find with the level of 15 % of tithonia forage meal, which differed (P<0.0424) in 118.13 μmoles/L from the control, although it was similar to the 20 % inclusion of this food that, in turn, did not differ from the control.

The determination of uric acid is carried out to evaluate the renal function of animals. Is the main product of protein catabolism in birds, constituting between the 60 and 80 % of the total nitrogen excreted in the urine, so serum concentrations higher than 308.57 μmoles/L, suggest alteration of renal function. Rodríguez (2017)Rodríguez, I. 2017. Potencialidades de Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray en la alimentación animal. Livestock Research for Rural Development, 29, Article # 63, ISSN: 2521-9952. Available at: http://www.lrrd.org/lrrd29/4/idal29063.html. [Consulted: September 25, 2021]. and Gutiérrez-Castro and Corredor-Mateus (2019)Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. find that the diets with higher substitutions of tithonia forage meal showed the highest uric acid values, so it is infer that when the birds intake a higher protein percentage , the uric acid excretion increase.

The alanine amino transferase and aspartate amino transferase enzymes showed normal values for all treatments, so the intake of levels of up to 20 % of tithonia forage meal did not cause health disorders in the animals. These enzymes refer the state of liver function. From these results it can be inferred that, since there were no significant differences between treatments, the birds did not have liver problems that could be attributed to the supplied diets.

The indicators of energy metabolism: glucose, cholesterol and triglycerides did not differ between treatments. The first two were in the normal range for the species: glucose (11-21 mmol/L) and cholesterol (2.58-5.17 mmol/L), according to Gálvez et al. (2009)Gálvez, C.F., Ramírez, G.F. & Osorio, J.M. 2009. El laboratorio clínico en hematología de aves exóticas. Biosalud, 8(1): 178-188, ISSN: 2462-960X. and Holguin et al. (2009)Holguín, V., Álvarez, P., Moreira, J. & Zambrano, A. 2009. Evaluación del estrés físico y la hepatoprotección en pollos de engorde. [En línea]. Available at: http://www.dspace.espol.edu.ec/handle/123456789/1873. [Consulted: June 10, 2023]., respectively. For triglycerides, the figures were higher than 0.45- 1.35 μmol/L, reported by Nunes et al. (2018)Nunes, R.V., Broch, J., Wachholz, L, De Souza, C., Damasceno, J., Oxford, J.H., Bloxham D.J.L., Billard, L. & Pesti, G.M. 2018. Choosing sample sizes for various blood parameters of broiler chickens with normal and non-normal observations. Poultry Science, 97(2): 3746-3754, ISSN: 1525-3171. https://doi.org/10.3382/ps/pey217. .

In the case of the replacement pullets, the blood biochemistry indicators: total proteins, uric acid and triglycerides (table 5) did not differ with the increase of the tithonia forage meal levels. The total proteins were in the normal intervals of 30-50 g/L (Miranda et al. 2007Miranda, S., Rincón-Reyes, H., Muñoz, R., Higuera, A., Arzaillez-Fischer, A.M. & Urdaneta, H. 2007. Parámetros productivos y química sanguínea en pollos de engorde alimentados con tres niveles dietéticos de harina de granos de frijol (Vigna unguiculata) (i) Walp durante la fase de crecimiento. Revista Científica (Maracaibo), 17(2): 150-160, ISSN: 2521-9715. ). It was observed that the highest figure of the uric acid was find with 20 % of tithonia forage meal and showed an increase of 83.00, 90.50 and 150.32 μmol/L respect to 0, 10 and 15 % of tithonia forage meal, respectively. Noticed that 15 % represent the half of the serum concentration of the inclusion of 20 % of tithonia forage meal (338.00 μmol/L). This last result should be analyzed, since it was refer in the above experiment, the uric acid, final product of the protein catabolism in birds, is increase with the protein levels (Gutiérrez-Castro and Corredor-Matheus 2019Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. ).

The lipid metabolism indicators cholesterol and triglycerides either differ between treatments. The cholesterol was in the normal range of (2.58-5.12 mmol/L) stipulated for birds (Holguín et al. 2009Holguín, V., Álvarez, P., Moreira, J. & Zambrano, A. 2009. Evaluación del estrés físico y la hepatoprotección en pollos de engorde. [En línea]. Available at: http://www.dspace.espol.edu.ec/handle/123456789/1873. [Consulted: June 10, 2023].).

It is of interest that the cholesterol levels are similar to those obtained with the broilers. According to Martínez (2004)Martínez, M. 2004. Efecto de un hidrolizado enzimático de crema de destilería tratada térmicamente en indicadores del metabolismo lipídico en reemplazo de ponedoras. Tesis en Máster en Bioquímica Nutricional. Facultad de Biología, Universidad de la Habana 63pp. the lipid fractions, are affected by the physiological and nutritive state of the bird.

From the physiological point of view, this type of birds show an increase in the lipid metabolism compared with broilers (Osorio and Florez 2011Osorio, J.H. & Flórez, J.D. 2011. Diferencias bioquímicas y fisiológicas en el metabolismo de lipoproteínas en aves comerciales. Biosalud, 10(1): 88-98, ISSN: 2462-960X. and Osorio and Florez 2018Osorio, J.H. & Flórez, J.D. 2018. Comparación de lípidos sanguíneos entre pollos de engorde y gallinas ponedoras. Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 65(1): 17-35, ISSN: 2357-3813. https://doi.org/10.15446/rfmvz.v65n1.72021.). Unfortunately, the total lipids which could clarify the differences in the lipid accumulation between males and females were not determined.

Caracterización química de la harina de forraje de Tithonia diversifolia

Para el estudio de la composición química se molió 1 kg de la harina de forraje a tamaño de partícula de 1 mm y se almacenó en frascos ámbar hasta el momento del análisis. El análisis de los indicadores de composición química se realizó por sextuplicado

Se realizó un análisis bromatológico para determinar materia seca (MS), proteína bruta (PB) y las cenizas (C) según AOAC (2019)AOAC Official Methods of Analysis. Association of Analytical Chemists. 2019. 21st Edition, Washington DC, USA.. El Ca se cuantificó en un equipo de absorción atómica. La determinación de fósforo (P) se realizó según la metodología de Amaral (1972)Amaral, A. 1972. Técnicas analíticas para evaluar macro nutrientes en cenizas de caña de azúcar. Laboratorio de nutrición de la caña. Escuela de Química. Universidad de La Habana, Cuba.. También se analizaron los componentes de la pared celular. La fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA), lignina (Lig) y celulosa (Cel) se determinaron de acuerdo con los procedimientos descritos por Göering y Van Soest (1970)Göering, H.K. & Van Soest, P.J. 1970. Forage fiber analyses (apparatus, reagents, procedures, and some applications). USDA - ARS Agric. Handbook. Washington: US Govt. Printying Office. p 20.. Por último, se realizaron los ensayos del tamizaje fitoquímico a la harina de forraje del material vegetal 10 según Miranda y Cuellar (2000)Miranda, M. & Cuéllar, A. 2000. Manual de prácticas de laboratorio. Farmacognosia y productos naturales. Facultad de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana, 40pp. Se investigó la presencia de 12 grupos funcionales: alcaloides, saponinas, triterpenos/esteroides, taninos, flavonoides, proantocianidinas, coumarinas, quinonas, azúcares reductores, grupos amino, resinas y cardenólidos. Los taninos condensados totales (TCT) se cuantificaron según los procedimientos del ensayo de Porter et al. (1986), modificado por Makkar (2003)Makkar, H.P.S. 2003. Cuantification of tannins in tres and shrub foliage. A laboratory manual Kluber Academic Publisher. Netherlands, 102pp..

Análisis estadístico

Se realizó análisis de estadística descriptiva (media, desviación estándar y coeficiente de variación (%). Para el procesamiento de los resultados se utilizó el programa estadístico Infostat (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., Gonzalez, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. Grupo InfoStat versión 2012. FCA Universidad Nacional de Córdoba Argentina. [En línea]. Available at: http://www.infostat.com.ar ).

Animales y dietas

Se utilizaron 40 pollos de engorde del híbrido cubano EB₂₄ de 42 días de edad y 32 pollitas de reemplazo de ponedoras White Leghorn L₃₃ de 18 semanas para evaluar el efecto del consumo de tithonia en indicadores morfométricos macroscópicos de órganos digestivos y accesorios del tracto gastrointestinal de ambos. En las pollitas de remplazo además se realizó una evaluación histopatológica cualitativa y cambios estructurales microscópicos en órganos digestivos y accesorios del tracto gastrointestinal. Todos los animales procedían de un experimento de comportamiento productivo. Los pollos de engorde se distribuyeron en cinco tratamientos (0, 5, 10, 15 y 20 %) de inclusión del material vegetal, mientras que para las pollitas se incluyeron cuatro niveles (0, 10, 15 y 20 %). La dieta base fue harina de soya como fuente proteica y maíz como fuente energética. En todos los casos se realizaron 8 repeticiones por tratamiento. Durante todo el tiempo de experimentación los animales tuvieron libre acceso al agua y al alimento. Las dietas experimentales se formularon según las recomendaciones nutricionales para el pollo de engorde de Rostagno et al. (2017)Rostagno, H.S., Albino, L.F., Hannas, H.I., Donzele, J.L., Sakomura, N.K., Perazzo, F.G., Saraiva, A., Teixeira, M.V., Rodríguez, P.B., Oliveira, R.F., Barreto, S.L. & Brito, C.O. 2017. Tabelas brasileiras para aves e suínos: composição de alimentos e exigencias nutricionais. 4ta edição. Viçosa, MG: Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Viçosa. 488p., mientras que para las pollitas se siguieron las recomendaciones de UECAN (2013)Unión de Empresas del Combinado Avícola Nacional (UECAN). 2013. Instructivo técnico para la crianza del reemplazo de ponedoras White Leghorn, MINAG.. Para la formulación de las dietas de los pollos de engorde, ver Savón et al. (2022)Savón, L.L, Rodríguez, B., Vázquez, Y., Scull, I., Herrera, M. & Ruiz, T.E. 2022. Immune response and blood biochemistry in broilers fed tithonia forage meal at the finishing stage. Cuban Journal of Agricultural Science, 56(2): 127-134, ISSN: 2079-3480. y en el caso de las pollitas ver Vázquez et al. (2021)Vázquez, Y., Rodríguez, B., Savón, L. & Ruiz, T.E. 2021. Efecto de la harina de forraje de Tithonia diversifolia en indicadores productivos de reemplazo de ponedoras White Leghorn L-33. Livestock Research for Rural Development, 33, Article #110, ISSN: 2521-9952. Available at: http://www.lrrd.org/lrrd33/9/33110ysnag.html. [Consulted: March 26, 2022]..

Procedimiento experimental

A los 42 días de edad se pesaron 8 aves por tratamiento (total de animales 40), y a las 18 semanas de edad se pesaron las pollitas de reemplazo de ponedora (total de animales 32), cuyos pesos se correspondió con el valor promedio de cada tratamiento. La selección se hizo sobre la base del peso promedio de cada grupo de aves sobre un rango del 10 % y se determinaron los indicadores que muestra el procedimiento experimental siguiente.

Indicadores morfométricos de órganos digestivos y accesorios

Las aves se sacrificaron dos horas y treinta minutos después de la ingestión de alimento por el método de desangrado de la vena yugular descrito por Sánchez (1990)Sánchez, A. 1990. Enfermedades de las aves. La Habana, Cuba: ENPES, 285 p.. Posteriormente, se siguió el procedimiento descrito por Savón et al. (2021)Savón, L.L., Rodríguez, B., Elías, A^ϯ, Scull, I., Herrera, M & Ortega, H.J^ϯ. 2021. Evaluación biológica de un producto fermentado seco basado en contenido de rumen (Vitarrum) para la alimentación y salud avícola. (folleto). IBSN: 9789597171-85-0. . Los datos de los órganos se expresaron como peso absoluto (g) y como peso relativo (g g peso vivo^-1 100). Las longitudes del intestino delgado, los ciegos y el colon-recto se midieron con una cinta métrica.

Evaluación histopatológica

Se utilizaron 32 pollitas de reemplazo de ponedoras que se sacrificaron según lo descrito por Savón et al. (2021)Savón, L.L., Rodríguez, B., Elías, A^ϯ, Scull, I., Herrera, M & Ortega, H.J^ϯ. 2021. Evaluación biológica de un producto fermentado seco basado en contenido de rumen (Vitarrum) para la alimentación y salud avícola. (folleto). IBSN: 9789597171-85-0. . Para el examen microscópico se tomaron cuatro muestras de 1 cm² de proventrículo, molleja, intestino delgado (íleon), los ciegos e hígado La evaluación histopatológica se realizó según POT (05.22.016) en el Laboratorio de Patología del Centro de Toxicología Experimental (CETEX) perteneciente al Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Para ello se utilizó un microscopio Motic, modelo BA410E.

Evaluación histológica (cuantitativa)

El proceso se inició realizando la observación de las láminas histológicas con el microscopio óptico MoticBA410E. Seguidamente se capturaron las imágenes correspondientes con una cámara para microscopía digital instantánea Motican 1080 BMH, con una resolución de 3 megapixeles, en un aumento de 40× y se analizaron dichas imágenes con el software para tratamiento de imágenes Motic® Images plus 3.0 (Motic China Group Co.).

Para el estudio morfométrico de los cortes histológicos del sistema digestivo se determinaron siete variables por animal que se midieron con ayuda del software de procesamiento y análisis de imágenes: en el proventrículo (altura de la mucosa, µm), diámetro de las yemas glandulares (µm); en la molleja: (altura de la mucosa (µm); en el intestino delgado: altura de las vellosidades (µm), ancho de las vellosidades (µm), profundidad de criptas de Lieberkühn (µm) y en los ciegos: altura de la mucosa (µm).

Posteriormente, las imágenes se archivaron en formato JPG para conservar todos los detalles observados al microscopio y a continuación se midieron las variables con ayuda del software de procesamiento y análisis de imágenes Motic. Se contabilizó un área por variable y por animal.

Indicadores de la bioquímica sanguínea

La muestra de sangre se tomó directamente de la vena yugular cuando los animales se sacrificaron. Se utilizaron 40 pollos de engorde y 32 pollitas de reemplazo (8 por tratamiento para ambas categorías). En pollos de engorde se determinó: colesterol, glucosa, triglicéridos, proteínas totales, albúmina y las enzimas alanino amino transferasa, aspartato amino transafera, y el ácido úrico. En el caso de las pollitas de reemplazo se analizaron: proteínas totales, colesterol, triglicéridos y glucosa. Todas las determinaciones se realizaron en el suero sanguíneo mediante un analizador automático Cobas integra 400PLUS (Roche Diagnostic System).

Diseño experimental y análisis estadístico

Los resultados del experimento de morfometría de pollos de engorde se analizaron según diseño completamente aleatorizado, se ajustó como covariable el peso al inicio de los animales. Los datos se procesaron con el paquete estadístico InfoStat 2012 (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., Gonzalez, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. Grupo InfoStat versión 2012. FCA Universidad Nacional de Córdoba Argentina. [En línea]. Available at: http://www.infostat.com.ar ). Para la comparación de medias se utilizó la dócima de Duncan (1955)Duncan, B. 1955. Multiple range and multiple F test. Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 1541-0420. https://doi.org/10.2307/3001478., para p<0.05, en los casos necesarios.

Para el experimento de indicadores morfométricos macroscópicos de órganos digestivos y accesorios del tracto gastrointestinal de pollitas de reemplazo de ponedoras, el diseño y análisis estadísticos fueron similares al empleado en los pollos de engorde.

En el caso de la evaluación morfométrica microscópica de los cambios estructurales en los órganos del sistema digestivo los datos obtenidos a partir de las mediciones realizadas se introdujeron en el paquete estadístico Graphpad, versión 8.1. A partir de los mismos se determinaron los estadígrafos descriptivos para cada indicador que se analizó. La normalidad se determinó por el test de Kolmogorov-Smirnov, corregida por Lilliefors (1967)Lilliefors, H.W. 1967. On the Kolmogorov-Smirnov Test for Normality with Mean and Variance Unknown. Journal of the American Statistical Association, 62(318): 399-402, ISSN: 1537-274X. http://doi.org/10.2307/2283970.. La homogeneidad de varianzas se determinó por el test de Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. Stanford University Press. pp. 278-292.. Cuando se cumplieron estas premisas, se realizó Análisis de Varianza (ANOVA) factorial simple teniendo en cuenta la variable grupo experimental; utilizando para determinar las diferencias el test de student. Cuando no se cumplió una o ambas premisas (normalidad u homogeneidad de varianza), se realizó un análisis no paramétrico a través de la prueba de Kruskal y Wallis (1952)Kruskal, W.H. & Wallis, W.A. 1952. Use of ranks on one-criterion variance analysis. Journal of the American Statistical Association, 47: 583-621, ISSN: 1537-274X. http://dx.doi.org/10.1080/01621459.1952.10483441. , utilizando para determinar las diferencias, la dócima no paramétrica de Dunn (1964)Dunn, O.J. 1964. Multiple comparation using rank Sums. Technometrics, 6(3): 241-252, ISSN: 1537-2723. https://doi.org/10.1080/004001706.1964.10490181. . Se trabajó para un nivel de significación de p<0.05.

Caracterización química y metabolitos secundarios de harina de forraje de T. diversifolia material vegetal 10

La harina de forraje de tithonia del material vegetal 10 mostró un aporte de 24.6 % de proteína bruta, 20.3 % de cenizas, 2.38 % de Ca, 36.07 % de fibra detergente neutro, 32.48 % de fibra detergente ácido y 25.87 % de celulosa, lo que la caracteriza como una fuente proteica alternativa alta en fibra.

El contenido de cenizas es un indicador de la proporción de compuestos inorgánicos presentes en la planta. En este estudio los niveles de cenizas fueron elevados, aspecto que está en correspondencia con las altas concentraciones de Ca que se hallaron y se relacionan con estudios previos (Fuentes-Martínez et al. 2019Fuentes-Martínez, B., Carranco-Jáuregui, M., Barrita-Ramírez, V., Ávila-González, E. & Sanginés-García, L. 2019. Effect of Tithonia diversifolia meal on productive e variables in laying hens. Abanico Veterinario, 9: 1-12, ISSN: 2007-428X. https://doi.org/10.21929/abavet2019.911 ). A pesar, que la fibra insoluble constituyó el componente mayoritario de la harina, los valores están dentro de lo indicado para alimento animal y son inferiores a los informados por Savón (2010)Savón, L. 2010. Harina de forrajes tropicales. Fuentes potenciales para la alimentación de especies monogástricas. Tesis presentada en opción del grado científico de Dr. en Ciencias. Instituto de Ciencia Animal. Universidad Agraria de la Habana. para un grupo de plantas tropicales.

El valor nutricional de un alimento depende entre otros factores, de la presencia de metabolitos secundarios. Estos compuestos pueden tener efectos beneficiosos o antinutricionales en el animal, en dependencia de su concentración, estructura química y biodisponibilidad, así como, de las características de la especie animal en cuestión (Scull 2018Scull, I. 2018. Caracterización química de la harina de forraje de Mucuna pruriens (L) DC vc utilis (Wallx Wight) L.H. Bailey y su evaluación como antioxidante natural para la alimentación animal. Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Veterinarias. Instituto de Ciencia Animal - Universidad de La Habana.). De los grupos funcionales buscados mediante las pruebas cualitativas del tamizaje fitoquímico se encontraron niveles bajos de alcaloides, compuestos fenólicos y triterpenos, metabolitos que pueden desencadenar una marcada actividad biológica en los animales.

González et al. (2019)González-Sierra, L., Díaz-Solares, M., Castro-Cabrera, I., Fonte-Carballo, L., Lugo-Morales, Y. & Altunaga-Pérez, N. 2019. Caracterización fitoquímica y actividad antioxidante total de diferentes extractos de Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray. Pastos y Forrajes, 42(3): 243-248, ISSN: 0864-0394. informaron la presencia de otros metabolitos secundarios en la planta que no fueron hallados en este estudio como: saponinas, coumarinas y quinonas. Esto se pudiera relacionar con la concentración insuficiente de estos compuestos en la harina para su detección efectiva con los procedimientos utilizados. Lo anterior puede estar determinado por variaciones en el metabolismo de estos compuestos debido a diferencias genéticas y estado fenológico. La ausencia de saponinas, coumarinas y las cantidades bajas de alcaloides y terpenos apunta a la calidad fitoquímica de la harina de este material como alimento animal. Estos compuestos secundarios esencialmente, pueden ocasionar trastornos nutricionales, pérdida de peso y dificultades gastrointestinales, cuando se encuentran en concentraciones altas o se utilizan en proporciones elevadas en la dieta (Scull et al. 2017Scull, I., Savón, L.L., Hormaza, J.V. 2017. Evaluation of secondary metabolites in the meal of Stizolobium aterrimun forage for its use in animal feeding. Pastos y forrajes, 40(4): 302-307, ISSN: 2078-8452.).

La cuantificación de las proporciones de compuestos fenólicos mostró valores de 9.83 y 3.85 g/kg de MS para los taninos totales (TT) y taninos condensados (TC), respectivamente referidos a cifras de proteína total (PT) de 19.45 g/kg MS. La baja concentración de TC, TT y PT corrobora los resultados del tamizaje fitoquímico y es comparable con los valores informados por García et al. (2008)García, D.E., Medina, M.G., Clavero, T., Humbría, J., Baldizán, A. & Domínguez, C.E. 2008. Preferencias de árboles forrajeros por cabras en las zonas bajas de los Andes venezolanos. Revista Científica, FCV-LUZ, XVIII(5): 549- 555, ISSN: 2521-9715. en árboles y arbustos forrajeros de uso en la alimentación animal. Al tener en cuenta lo anterior, este grupo de compuestos debe causar efectos benéficos en el animal e incidir de forma positiva en su actividad biológica. Según González-Sierra et al. (2019)González-Sierra, L., Díaz-Solares, M., Castro-Cabrera, I., Fonte-Carballo, L., Lugo-Morales, Y. & Altunaga-Pérez, N. 2019. Caracterización fitoquímica y actividad antioxidante total de diferentes extractos de Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray. Pastos y Forrajes, 42(3): 243-248, ISSN: 0864-0394., la actividad antioxidante que posee la T. diversifolia se asocia a la presencia de flavonoides y otros compuestos fenólicos presentes en la planta.

Indicadores morfométricos macroscópicos de órganos digestivos y accesorios del tracto gastrointestinal de pollos y pollitas de reemplazo de ponedoras

Una vez determinada la composición química y los metabolitos secundarios presentes en la harina de forraje de Tithonia diversifolia material vegetal 10, se evaluó el efecto del consumo de esta arbórea en indicadores morfométricos y órganos accesorios del tracto gastrointestinal de pollos de engorde y pollitas de reemplazo de ponedoras.

En los pollos de engorde, los pesos relativos del tracto gastrointestinal vacío, molleja llena, intestino delgado vacío y colon-recto lleno fueron similares para todos los tratamientos experimentales (tabla 1). Lo anterior implica que el consumo de harina de forraje de tithonia no influyó en los pesos relativos de estos órganos. En contraposición, se observó que el 20 % de este alimento fibroso produjo un incremento del peso de la molleja vacía, que se asocia con una mayor actividad del órgano como resultado de las cantidades crecientes de fibra insoluble provistas por la inclusión de tithonia en las dietas (Jiménez-Moreno et al. 2010Jiménez-Moreno, E., González-Alvarado, J.M., González-Sánchez, D., Lázaro, R. & Mateos, G.G. 2010. Effects of type and particle size of dietary fiber on growth performance and digestive traits of broilers from 1 to 21 days of age. Poultry Science, 89(10): 2197-2212, ISSN: 1525-3171. https://doi.org/10.3382/ps.2010-00771. ).

La longitud relativa del intestino delgado de las aves fue similar para todos los tratamientos experimentales, con excepción del tratamiento 10 % de harina de forraje de tithonia que disminuyó con respecto a los niveles de 15 y 20 % de sustitución. En cuanto a los ciegos, la longitud relativa del ciego izquierdo de las aves que consumieron la dieta control, 5 y 10 % de inclusión de harina de forraje de tithonia no difirieron entre sí, pero sí se incrementó con los niveles de 15 y 20 %. Esto se debe a una respuesta fisiológica que se provoca por el aumento del tiempo de permanencia de las partículas fibrosas en este órgano, la acción de la masa microbiana y productos finales de fermentación. Estas secciones dentro del tubo digestivo son el único lugar donde se produce la digestión de la fibra dado la actividad fermentativa que poseen las bacterias y hongos celulolíticos ahí presentes (Rodríguez et al. 2012Rodríguez, Z., Martínez, M., Sarmiento, L., Pérez, M., Dihigo, L.E., Núñez, O., Herrera, F.R. & Hernández, Y. 2012. Harina de forraje de Mucuna deeringiana en algunos grupos fisiológicos microbianos e indicadores fermentativos del ciego de pollos de ceba. Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 46(2): 193-198, ISSN: 0034-7485.). La magnitud de la respuesta se puede afectar por la composición físico-química de la fibra presente en la dieta (Savón 2010Savón, L. 2010. Harina de forrajes tropicales. Fuentes potenciales para la alimentación de especies monogástricas. Tesis presentada en opción del grado científico de Dr. en Ciencias. Instituto de Ciencia Animal. Universidad Agraria de la Habana.).

El consumo de 20 % de harina de forraje de tithonia ocasionó un incremento del peso relativo del buche tanto lleno como vacío (tabla 2). El consumo elevado de fibra insoluble aportado por la harina de forraje de tithonia incrementó el volumen del órgano y alteró su morfología.

El consumo de harina de forraje de tithonia no influyó en los pesos relativos del proventrículo lleno y vacío, del colon recto vacío y de la grasa abdominal (tabla 2). Sin embargo, sí se observó un incremento significativo del peso relativo de los ciegos llenos, en relación con el tratamiento control con niveles crecientes de fibra.

Lo anterior, no se debió a procesos fermentativos que ocurre en esta sección del tracto gastrointestinal, ya que el ciego vacío no mostró diferencias entre tratamientos. Es posible que la fibra contenida en la digesta, arrastre agua en su matriz y esto origine que se incremente el contenido de los ciegos. La longitud relativa del colon-recto fue similar. El análisis de los órganos accesorios del tracto gastrointestinal (hígado y páncreas) no mostró diferencias entre tratamientos.

En cuanto a las pollitas de reemplazo de ponedoras, se halló que la inclusión del 15 y 20 % de la harina de forraje de tithonia incrementó el peso relativo del tracto gastrointestinal vacío de las aves, lo que se asocia con el aumento de su capacidad digestiva al consumir este alimento voluminoso (Savón et al. 2019Savón, L, Rodríguez, B., Vázquez, Y., Herrera, M. & Ruiz, T. 2019. Indicadores fisiológicos y de la bioquímica sanguínea de pollitas de reemplazo de ponedoras. Convención Internacional Agrodesarrollo, 25-29 octubre, Hotel Meliá Varadero, Matanzas, Cuba). Estos niveles, también aumentaron el peso relativo de la molleja, efecto similar al que se observó anteriormente en pollos de engorde.

Un resultado interesante se obtuvo en la longitud relativa del intestino delgado (cm/gPVx100) que se incrementó con los niveles de harina de forraje de tithonia (8.89, 9.20, 9.59 y 10.43 para 0, 10, 15 y 20 %, respectivamente) (p<0.0515), muy cerca de p<0.05. Esto indica que hay diferencias desde el punto de vista biológico.

La longitud del intestino delgado pudiera relacionarse con la superficie de la mucosa intestinal y un incremento de ésta implicaría una mayor absorción de nutrientes, lo que conllevaría a un buen desarrollo corporal de la futura ponedora (Savón et al. 2017Savón, L., Mora, L.M., Dihigo, L.E. & Ruiz, T.E. 2017. Use of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray in non-ruminants. CHAPTER XII En: Morera, Moringa y Tithonia in animal feeding and other interest uses results in Latin America, Cuba and the Caribbean. ISBN: 978-959-7171-72-0. ). Esto necesariamente incide en la respuesta productiva y reproductiva de las pollitas. La longitud del colon-recto no se alteró con los diferentes niveles de harina de forraje de tithonia en la dieta. La harina no influyó en los restantes indicadores fisiológicos evaluados.

Efecto del consumo de harina de forraje de tithonia en la histología de órganos digestivos y accesorios del tracto gastrointestinal de pollitas de reemplazo de ponedoras

En el caso de las pollitas de reemplazo debido a la importancia de esta categoría, se realizó un estudio histopatológico con el fin de indagar si el consumo de tithonia era capaz de provocar una lesión a nivel de los tejidos de los órganos digestivos y accesorios de esta categoría.

Se analizaron el proventrículo, molleja, ciegos e hígado. Se observó que los cambios hallados a nivel de tejido en el proventrículo, molleja e hígado no eran atribuibles al consumo de tithonia, ya que se encontraron tanto en animales controles como los q consumieron harina de forraje de tithonia.

El hallazgo más importante se identificó en los ciegos, donde se observó una hipertrofia moderada de las tonsilas cecales que se presentó en los animales de los tratamientos experimentales y con una incidencia del 50, 25 y 12.5 % para los grupos de 2, 3 y 4, respectivamente. Las tonsilas cecales son un tejido linfoide especializado y su hipertrofia pudo estar relacionada con la administración del material vegetal en estudio. Estas estructuras se exponen de manera directa al bolo alimenticio durante el proceso de digestión, que contiene alimento, agentes patógenos o vacunas. Esto permite el reconocimiento de antígenos con la producción de respuestas inmunes efectoras en este nivel. El hecho de que la incidencia de este cambio fuera mayor en el grupo administrado con el nivel más bajo de tithonia puede estar relacionado con la individualidad de la respuesta inmune de cada individuo. Lo anterior tiene una gran importancia en el estudio de la respuesta inmune.

Evaluación estructural cuantitativa de los cambios morfométricos en órganos digestivos de pollitas de reemplazo de ponedoras, que consumen harina de forraje de T. diversifolia

La dieta es uno de los factores más importantes en la modulación del desarrollo estructural y funcional del intestino. El cambio de dieta al que se enfrenta el animal, se acompaña de modificaciones en las funciones digestivas y de transporte con lo que se adquieren las características del órgano maduro. Es por ello que es importante realizar un estudio morfométrico de estructuras del sistema digestivo con el fin de cuantificar los cambios asociados a la administración de las dietas con la inclusión de diferentes niveles de harina de forraje de tithonia.

La tabla 3 señala el estudio morfométrico de los valores de los estadígrafos media y desviación estándar de cada variable evaluada, por grupo experimental. Se puede observar que sólo hubo diferencias estadísticas significativas en el ancho de las vellosidades intestinales, entre el grupo control y el administrado con el 20 % de la harina de tithonia (p=0.0153). Este resultado posiblemente esté asociado a la administración de la mayor concentración (20 %) de harina de forraje de tithonia y confirma el incremento hallado en la longitud del intestino delgado en el estudio de los indicadores morfométricos macroscópicos.

En la figura 1 se muestran las diferencias entre el ancho de las vellosidades del íleon de las aves que recibieron la dieta control (A) y las del tratamiento con 20 % de inclusión de harina de forraje de tihonia (B).

El resto de las variables estudiadas no difirieron entre tratamientos. Es importante destacar que, aunque no se observó diferencia estadística significativa en cuanto a la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas entre los grupos experimentales, los resultados muestran incremento de los valores en la medida que aumenta la concentración del alimento en la dieta.

Indicadores de la bioquímica sanguínea en pollos de engorde y pollitas de reemplazo de ponedoras que consumen niveles diferentes de harina de forraje de T. diversifolia

Los indicadores de la bioquímica sanguínea son recursos que se utilizan para evaluar el estado fisiológico y estimar el comportamiento nutricional del animal, a vez que proporciona un conocimiento del metabolismo y del funcionamiento de órganos como el riñón e hígado de las aves (Gutiérrez-Castro y Corredor-Mateus 2019Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. ) y su determinación es una herramienta importante en el seguimiento de la salud de todas las especies.

En la tabla 4 se muestran indicadores de la bioquímica sanguínea de pollos de engorde de 42 días de edad alimentados con harina de forraje de tithonia.

Los indicadores séricos del metabolismo proteico: proteínas totales, albúmina y relación albúmina/globulina no difirieron entre tratamientos, a excepción del ácido úrico. En relación con las proteínas totales se informan como valores normales 30-50 g/L (Miranda et al. 2007Miranda, S., Rincón-Reyes, H., Muñoz, R., Higuera, A., Arzaillez-Fischer, A.M. & Urdaneta, H. 2007. Parámetros productivos y química sanguínea en pollos de engorde alimentados con tres niveles dietéticos de harina de granos de frijol (Vigna unguiculata) (i) Walp durante la fase de crecimiento. Revista Científica (Maracaibo), 17(2): 150-160, ISSN: 2521-9715. ) y 35.6 ± 0.34 g/L (Nunes et al. 2018Nunes, R.V., Broch, J., Wachholz, L, De Souza, C., Damasceno, J., Oxford, J.H., Bloxham D.J.L., Billard, L. & Pesti, G.M. 2018. Choosing sample sizes for various blood parameters of broiler chickens with normal and non-normal observations. Poultry Science, 97(2): 3746-3754, ISSN: 1525-3171. https://doi.org/10.3382/ps/pey217. ), en tanto que Café et al. (2012)Café, M., Pereira, F., Ribeiro, H., Bueno de Mattos, M., Mundim, A. & Prazeres, C. 2012. Biochemical blood parameters of broilers at different ages under thermoneutral environment. World`s Poultry Science Journal, Suppl. 1: 143-146, ISSN: 1743-4777. indican cifras de 26.5 g/L que se aproximan a las obtenidas en este experimento. Al respecto, las diferencias se pueden deber a la influencia de diversos factores como las dietas, raza y condiciones ambientales en que se ejecutaron los experimentos.

Los valores de albúmina se ubicaron dentro del intervalo conocido para este indicador (10.8 - 16 g/L), según Gálvez et al. (2009)Gálvez, C.F., Ramírez, G.F. & Osorio, J.M. 2009. El laboratorio clínico en hematología de aves exóticas. Biosalud, 8(1): 178-188, ISSN: 2462-960X., lo que sugiere que los niveles de harina de forraje de tithonia estudiados, no afectaron la síntesis de proteína a nivel hepático. En relación con las globulinas (teniendo en cuenta que se calculan como la diferencia entre las proteínas totales y la albúmina) fueron muy bajos comparados con los obtenidos por Gutiérrez-Castro y Corredor-Mateus (2019)Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. (17-20 g/L) con harina de tithonia (no especifica si es de hoja o de forraje). A pesar de esto, la relación albúmina/globulina se considera bastante favorable e indicativa de que las aves se encontraban bien desde el punto de vista nutricional, ya que se halla cerca de 1 que es la relación óptima.

El ácido úrico sérico depende tanto de la calidad como de la cantidad de proteínas suministradas en la dieta. La cifra más elevada se halló con el nivel de 15 % de harina de forraje de tithonia que difirió (p<0.0424) en 118.13 μmoles/L del control, aunque fue similar al 20 % de inclusión de este alimento, la que a su vez no difirió del control.

La determinación de ácido úrico se realiza para evaluar la función renal de los animales. Es el principal producto del catabolismo proteico en las aves, constituyendo entre el 60 y 80 % del total de nitrógeno excretado en la orina, por lo cual concentraciones séricas superiores a 308.57 μmoles/L, sugieren alteración de la función renal. Rodríguez (2017)Rodríguez, I. 2017. Potencialidades de Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray en la alimentación animal. Livestock Research for Rural Development, 29, Article # 63, ISSN: 2521-9952. Available at: http://www.lrrd.org/lrrd29/4/idal29063.html. [Consulted: September 25, 2021]. y Gutiérrez-Castro y Corredor-Mateus (2019)Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. hallaron que las dietas con mayores sustituciones de harina de forraje de tithonia mostraron los mayores valores ácido úrico, por lo que se infiere que al consumir las aves un mayor porcentaje de proteína, se incrementa la excreción de ácido úrico.

Las enzimas alanina amino transferasa. y aspartato amino transferasa mostraron valores normales para todos los tratamientos, por lo que el consumo de niveles de hasta 20 % de harina de forraje de tithonia no ocasionó trastornos en la salud de los animales Estas enzimas refieren el estado de la función hepática. De estos resultados se puede inferir que, dado que no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, las aves no presentaron problemas hepáticos que se pudieran atribuir a las dietas suministradas.

Los indicadores del metabolismo energético: glucosa, colesterol y triglicéridos no difirieron entre tratamientos. Los dos primeros se hallaron en el intervalo normal para la especie: glucosa (11-21 mmol/L) y colesterol (2.58-5.17 mmol/L) según Gálvez et al. (2009)Gálvez, C.F., Ramírez, G.F. & Osorio, J.M. 2009. El laboratorio clínico en hematología de aves exóticas. Biosalud, 8(1): 178-188, ISSN: 2462-960X. y Holguín et al. (2009)Holguín, V., Álvarez, P., Moreira, J. & Zambrano, A. 2009. Evaluación del estrés físico y la hepatoprotección en pollos de engorde. [En línea]. Available at: http://www.dspace.espol.edu.ec/handle/123456789/1873. [Consulted: June 10, 2023]., respectivamente. En el caso de los triglicéridos, las cifras fueron superiores a 0.45-1.35 μmol/L señalado por Nunes et al. (2018)Nunes, R.V., Broch, J., Wachholz, L, De Souza, C., Damasceno, J., Oxford, J.H., Bloxham D.J.L., Billard, L. & Pesti, G.M. 2018. Choosing sample sizes for various blood parameters of broiler chickens with normal and non-normal observations. Poultry Science, 97(2): 3746-3754, ISSN: 1525-3171. https://doi.org/10.3382/ps/pey217. .

En el caso de las pollitas de remplazo, los indicadores de la bioquímica sanguínea: proteínas totales, ácido úrico, colesterol y triglicéridos (tabla 5) no difirieron con el incremento de los niveles de harina de forraje de tithonia. Las proteínas totales se hallaron en los intervalos normales de 30-50 g/L (Miranda et al. 2007Miranda, S., Rincón-Reyes, H., Muñoz, R., Higuera, A., Arzaillez-Fischer, A.M. & Urdaneta, H. 2007. Parámetros productivos y química sanguínea en pollos de engorde alimentados con tres niveles dietéticos de harina de granos de frijol (Vigna unguiculata) (i) Walp durante la fase de crecimiento. Revista Científica (Maracaibo), 17(2): 150-160, ISSN: 2521-9715. ). Se observó que la cifra más elevada de ácido úrico se encontró con el 20 % de harina de forraje de tithonia y representó un incremento de 83.00, 90.50 y 150.32 սmol/L respecto al 0, 10 y 15 % de harina de forraje de tithonia, respectivamente. Nótese que el 15 % representa la mitad de la concentración sérica de la inclusión del 20 % de harina de forraje de tithonia (338.00 μmol/L). Este último resultado se debe analizar, ya que según se refirió en el experimento anterior, el ácido úrico, producto final del catabolismo proteico en las aves, se incrementa con los niveles de proteína (Gutiérrez-Castro y Corredor-Matheus 2019Gutiérrez-Castro, L.L & Corredor-Mateus, J.R. 2019. Química sanguínea en pollos de engorde alimentados con harina de botón de oro en fase de finalización. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 14(3): 42-52, ISSN: 1900-9607. https://dx.doi.org/10.21615/cesmvz.143.4. ).

Los indicadores del metabolismo lipídico colesterol y triglicéridos tampoco difirieron entre tratamientos. El colesterol se encontró en el rango normal de (2.58-5.12 mmol/L) estipulado para las aves (Holguín et al. 2009Holguín, V., Álvarez, P., Moreira, J. & Zambrano, A. 2009. Evaluación del estrés físico y la hepatoprotección en pollos de engorde. [En línea]. Available at: http://www.dspace.espol.edu.ec/handle/123456789/1873. [Consulted: June 10, 2023].).

Llama la atención que los niveles de colesterol son similares a los obtenidos con los pollos de engorde. Según Sturkie (2000) citado por Martínez (2004)Martínez, M. 2004. Efecto de un hidrolizado enzimático de crema de destilería tratada térmicamente en indicadores del metabolismo lipídico en reemplazo de ponedoras. Tesis en Máster en Bioquímica Nutricional. Facultad de Biología, Universidad de la Habana 63pp. las fracciones lipídicas, están afectadas por el estado fisiológico y nutritivo del ave.

Desde el punto de vista fisiológico, este tipo de aves manifiesta un incremento en el metabolismo lipídico comparado con pollos de ceba (Osorio y Florez 2011Osorio, J.H. & Flórez, J.D. 2011. Diferencias bioquímicas y fisiológicas en el metabolismo de lipoproteínas en aves comerciales. Biosalud, 10(1): 88-98, ISSN: 2462-960X. y Osorio y Florez 2018Osorio, J.H. & Flórez, J.D. 2018. Comparación de lípidos sanguíneos entre pollos de engorde y gallinas ponedoras. Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 65(1): 17-35, ISSN: 2357-3813. https://doi.org/10.15446/rfmvz.v65n1.72021.). Desafortunadamente, no se determinaron los lípidos totales que hubieran podido esclarecer las diferencias en la acumulación lipídica entre machos y hembras.