The present study describes the production of lignocellulases enzymes from
Although there are worldwide researches focused on the production of basidiomycete fungi ligninases, as a biological method to reduce lignin content of biomass (
The species of Trichoderma are widely distributed in all latitudes, and occur naturally in different environments, especially in those that contain organic matter or decomposing plant wastes. They have the ability to produce several metabolites and adapt to various environmental conditions and substrates, this gives the Trichoderma genus the possibility of being use in the biotechnology industry.
Laccases generally produced from fungi are accompanied by other types of compounds such as isoforms, proteases, cellulases and other compounds derived from crude extract production (
The mutant strain identified in previous studies as
For these reason, it is necessary to elucidate and define the methodologies, design parameters and operating conditions for the separation, concentration and purification of ligninolytic enzymes synthesized by this strain. The objective of this research was to study the production of lignocellulases enzymes from
Culture medium
Quantity (1L)
Glucose
10.0 g
Potassium phosphate
2.0 g
Magnesium sulphate
0.5 g
Malt extract
3.5 g
Yeast extract
2.0 g
Bactopeptone
0.1g
Metallic salts solution
1.0mL
Copper sulphate
0.5 mg
Magnesium sulphate
0.16 mg
Zinc sulphate
1.14 mg
Cobalt chloride
0.29 mg
Content
Grams
Proteins
6.0 0
Fats
1.50
Available carbohydrates
18.00
Sugars
7.00
Dietary fiber
11.00
Sodium
0.11
Xylanase activity was determined by mixing 0.9 mL of 1% (w/v) birch wood xylan (prepared in 50 mM Sodium-citrate buffer, pH 5.3) with 0.1 mL of suitably diluted enzyme and the mixture was incubated at 50 °C for 5 min (
The enzymatic assay of laccase and lignin peroxidase activity was carried out according to the methodology proposed by
Laccase activity was determined with a spectrophotometer, by syringaldazine oxidation under aerobic conditions. The resulting violet color was measured at 530 nm. The analytical conditions were 5 mM of syringaldazine, 50 mM buffer citrate, pH 4.5, 30°C and 1 minute reaction time. A laccase unit (U) is the amount of enzyme that catalyzes the conversion of 1.0 mmol of syringaldazine per minute under these conditions. Lignin peroxidase was determined by the H2O2-dependent oxidative dimerization of 2.4-dichlorophenol at 25°C, where the reaction mixture contained 26 mM of 4-amino-antipyrin, 20 mM of 2.4-dichlorophenol and 3 mM of H2O2 in 20 mM with pH 4.5 of sodium succinate. The change in absorbance was monitored at 510 nm (ε = 1.85x104 M-1cm-1).
Differences between maximum enzyme production and low values found in relation to fermentation time suggest that they may be related to wheat bran chemical composition, that do not favor the action of exoglucananase and the rest. This requires additional experimental justification.
Cellulase production in cultures is associated with growth and is influenced by various parameters including the nature of cellulosic substrate, medium pH and nutrient availability. In addition, a large-scale production of cellulases requires understanding and proper control of the growth and enzyme production capabilities of the producer (
This result differs from the fermentation in sugar cane bagasse in terms of production time of the enzyme, where cellulolytic activity is higher. The major technical limitation in fermentative production of cellulases remains the increased fermentation times with low productivity (
These values are similar to those reported in some basidiomycetes. According to
Lignin degradation is catalyzed by an extracellular complex produced by some fungi, when they have been exposed to nutrient limiting conditions in the culture medium (
According to
Laccase activity can be detected in lignin bioassays as the only carbon source, although the analytical tests for lignin determination make them expensive. However, other organic compounds such as syringaldazine, used in this study, are also substrates of others lignin-modifying enzymes, for example the lignin peroxidase, where the activity is easily revealed by a change in the coloring of the culture medium (Mehandia
The results of the assay to detect lignin peroxidase did not show rapid activity. Notable changes in the coloration of substrate were manifested after 5 min of the enzymatic reaction (
Kinetics of peroxidase production by the
In this study, a positively charged DEAE sepharose matrix was used, which allowed the enzyme to be negatively charged above its isoelectric point and could adhere to the matrix, and as a consequence could be eluted by pH variation or ionic strength.
During the study, different bands associated with the presence of laccases were observed in the exchange columns, so the activity test of this enzyme was performed on the different collected fractions. According to the dish test, it was determined that the
The fractions with eluted laccase activity, showed different chromatographic performances, which could be closely associated to their structure. The first eight fractions, as well as the fractions from eighteen to twenty-seven, were joined to form two new fractions called Fraction I and Fraction II. These fractions were again concentrated by membrane filtration with nitrogen current.
It was found that Enzymatic Fraction I showed higher laccase activity than the most retained Enzymatic Fraction II, due to the low activity of this fraction. Purification parameters of laccase from
Specific activity of the enzymatic extract in this Fraction was increased by achieving the removal of a large part of the contaminating proteins and reaching a purification factor higher than twelve, which indicates that this Fraction is twelve times purer than the initial preparation. The purification scheme used in this study also allowed not compromising the enzyme yield, obtaining a value of 182 %.
Regarding the overall performance of the process, this study coincides with the results proposed by
Another aspect that should be highlighted is the use of wheat bran as raw material for obtaining ligninase enzymes and the selection of fermentation system in submerged solid medium that guarantees a faster and simpler obtaining process. It is also necessary to point out the effectiveness of the purification system used in this study in the selective separation of laccase enzymes present in the crudes.
There are several methods that are used for the separation and purification of laccases from raw fungus extracts. These include chromatographic methods, ultra centrifugation, phase formation, precipitation and ultra-filtration. These methods are used depending on the utility pursued with the purified protein, whether it is identification or improvement of a subsequent process (
To select the specific purification method for laccases, factors such as: application availability, enzyme activity conservation, purification efficiency and amount of purified protein must be taken into account. With these factors, centrifugation is initially ruled out to separate laccase because this method is ideal for separating enzymes from biomass remnants in the enzyme extract and for analyzing structures and variable separation times. However, the use of this method generates phases where the target protein is, together with other proteins of similar molecular weight, which creates confusion. In addition, structural modifications of protein occur, which affects the performance of the enzymatic activity (
It is important to highlight that chromatographic methods are the most used to purified enzymes, but sometimes yields are not so high. This is a problem, especially if it is intended to use the purified enzyme in pretreatment processes of lignocellulosic material. In general, these methods are used in the identification and molecular study of proteins (
It is concluded that
Esta investigación describe la producción de enzimas lignocelulasas del
Aunque existen investigaciones por todo el mundo enfocadas en la producción de ligninasas de hongos bacidiomicetos, como método biológico para reducir el contenido de lignina en la biomasa (
Las especies de Trichoderma están ampliamente distribuidas en todas las latitudes, y se encuentran naturalmente en diversos ambientes, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos de plantas en descomposición. Tienen la habilidad de producir varios metabolitos y adaptarse a múltiples sustratos y condiciones ambientales. Esto posibilita que el género Trichoderma pueda utilizarse en la industria biotecnológica.
Las lacasas que generalmente provienen de hongos están acompañadas de otros tipos de compuestos como los isoformes, proteasas, celulasas y otros compuestos derivados de la producción de extracto crudo (
La cepa mutante identificada en estudios anteriores como
Por esta razón, es necesario dilucidar y definir las metodologías, indicadores de diseño y condiciones de funcionamiento para separar, concentrar y purificar enzimas lignolíticas sintetizadas por esta cepa. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue analizar la producción de enzimas lignocelulasas de
Medio de cultivo
Cantidad (1L)
Glucosa
10 g
Fosfato de potasio
2 g
Sulfato de magnesio
0.5 g
Extracto de malta
3.5 g
Extracto de levadura
2 g
Bactopeptona
0.1g
Solución de sales metálicas
1.0mL
Sulfato de cobre
0.5 mg
Sulfato de magnesio
0.16 mg
Sulfato de zinc
1.14 mg
Cloruro de cobalto
0.29 mg
Contenido
Gramos
Proteínas
6.0
Grasas
1.5
Carbohidratos disponibles
18.0
Azucares
7.0
Fibra dietética
11.0
Sodio
0.11
La actividad de xilanasa se determinó mezclando 0,9 mL de xilano de madera de abedul al 1% (p/v) (preparado en solución tampón de citrato de sodio 50 mM, con pH 5,3) con 0,1 mL de enzima adecuadamente diluida, y la mezcla se incubó a 50 °C durante 5 min (
El ensayo enzimático de la actividad de lacasa y lignina peroxidasa se realizó de acuerdo con la metodología propuesta por
La actividad de la lacasa se determinó por espectrofotometría, por la oxidación de siringaldazina en condiciones aeróbicas. El color violeta producido se midió a 530 nm. Las condiciones analíticas en las que se desarrolló fueron 5 mM de siringaldazina, 50 mM de solución tampón de citrato, pH 4,5, 30 ° C y 1 minuto de tiempo de reacción. Una unidad de lacasa (U) representa la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1,0 mmol de siringaldazina por minuto en estas condiciones. La lignina peroxidasa se determinó mediante la dimerización oxidativa dependiente de H2O2 de 2,4-diclorofenol a 25 ° C, donde la mezcla de reacción contenía 26 mM de 4-amino-antipirina, 20 mM de 2,4-diclorofenol y 3 mM de H2O2 en 20 mM con pH de 4.5 de succinato de sodio. El cambio en la absorbancia se controló a 510 nm (ε = 1.85x104 M-1cm-1).
Las diferencias entre la producción máxima de enzimas y los valores bajos encontrados en relación con el tiempo de fermentación sugieren que pueden estar relacionados con la composición química del salvado de trigo que no favorece la acción de la exoglucananasa y del resto. Esto requiere una justificación experimental adicional.
La producción de celulasa en cultivos se asocia con el crecimiento y varios indicadores, que incluyen la naturaleza del sustrato celulósico, el pH del medio y la disponibilidad de nutrientes, influyen en ella. Además, la producción a gran escala de celulasas requiere comprensión y control del crecimiento y de las capacidades de producción enzimática (
Este resultado difiere de la fermentación en bagazo de caña en términos de tiempo de producción de la enzima, donde la actividad celulolítica es mayor. La principal limitación técnica en la producción fermentativa de celulasas continua siendo el aumento de los tiempos de fermentación con baja productividad (
Estos valores son similares a los informados en algunos basidiomicetos. Según
La degradación de la lignina se catalizó por un complejo extracelular producido por algunos hongos, cuando se expusieron a condiciones limitantes de nutrientes en el medio de cultivo (
Según
La actividad de la lacasa se puede detectar en los bioensayos de lignina como única fuente de carbono, aunque las pruebas analíticas para la determinación de la lignina los convierten en costosos. Sin embargo, otros compuestos orgánicos como la siringaldazina, utilizada en este estudio, también son sustratos de otras enzimas modificadoras de lignina, como la lignina peroxidasa, donde la actividad se revela fácilmente por un cambio en la coloración del medio de cultivo (Mehandia
Los resultados del ensayo para detectar la peroxidasa de lignina no mostraron actividad rápidamente. Los cambios notables en la coloración del sustrato se manifestaron después de 5 minutos de la reacción enzimática (
La cinética de la producción de peroxidasa por la cepa
En este estudio, se utilizó una matriz de DEAE sepharose cargada positivamente, que permitió que la enzima se cargara negativamente por encima de su punto isoeléctrico y pudiera adherirse a la matriz, y como consecuencia, pudiera eluirse por la variación del pH o la fuerza iónica.
Durante el estudio, se observaron diferentes bandas asociadas con la presencia de lacasas en las columnas de intercambio, por lo que la prueba de actividad de esta enzima se realizó en las diferentes fracciones recogidas. De acuerdo con la prueba en placa, se determinó que el hongo
Las fracciones con actividad lacasa eluidas, mostraron diferentes comportamientos cromatográficos que podrían estar estrechamente asociados a su estructura. Las primeras ocho fracciones, así como las fracciones del dieciocho al veintisiete, se unieron para formar dos nuevas fracciones llamadas fracción I y fracción II, las cuales se concentraron nuevamente por filtración de membrana con corriente de nitrógeno.
Se encontró que la fracción enzimática I mostró mayor actividad de lacasa que la fracción enzimática II más retenida, debido a la baja actividad de esta fracción. Los indicadores de purificación de lacasa de
La actividad específica del extracto enzimático en esta fracción se incrementó al lograr la eliminación de gran parte de las proteínas contaminantes y al alcanzar un factor de purificación de más de doce, lo que indica que esta fracción es doce veces más pura que la preparación inicial. El esquema de purificación utilizado en este estudio no permitió comprometer el rendimiento de la enzima, obteniendo un valor de 182 %.
Con respecto al comportamiento general del proceso, este estudio coincide con los resultados propuestos por
Otro aspecto que debe destacarse es el uso de salvado de trigo como materia prima para producir enzimas ligninasas y la selección del sistema de fermentación en medio sólido sumergido que garantiza un proceso de obtención más rápido y sencillo. También es necesario señalar la efectividad del sistema de purificación utilizado en este estudio en la separación selectiva de las enzimas lacasa presentes en los crudos.
Existen varios métodos que se utilizan para la separación y purificación de las lacasas a partir de extractos crudos de hongos. Estos incluyen métodos cromatográficos, ultra centrifugación, formación de fases, precipitación y ultrafiltración. Estos métodos se usan en dependencia de la utilidad que se persigue con la proteína purificada, ya sea para identificar o mejorar un proceso posterior (
Para seleccionar el método específico de purificación para las lacasas, deben tenerse en cuenta factores como disponibilidad de aplicación, conservación de la actividad enzimática, eficiencia de purificación y cantidad de proteína purificada. Con estos factores, se descarta inicialmente la centrifugación para separar la lacasa porque este método es ideal para separar las enzimas de los restos de biomasa en el extracto enzimático y para analizar estructuras y tiempos variables de separación. Sin embargo, el uso de este método genera fases donde se encuentra la proteína diana con otras proteínas de peso molecular similar, lo cual crea confusión. Además, se producen modificaciones estructurales de la proteína, lo que afecta el comportamiento de la actividad enzimática (
Es importante resaltar que los métodos cromatográficos son los más utilizados para purificar enzimas, pero algunas veces los rendimientos no son tan altos. Esto es un problema, especialmente si se trata de utilizar la enzima purificada en procesos de pretratamiento de material lignocelulósico. En general, estos métodos se emplean para identificación y estudio molecular de proteínas (
Se concluye que la cepa